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Tomasz Janczi

• ADAM15, which belongs to the family of the disintegrin and metalloproteinases, is a multi-domain transmembrane protein. A strongly upregulated expression of ADAM15 is found in inflamed synovial membranes from articular joints affected by osteoarthritis and especially rheumatoid arthritis (RA). During the chronic inflammatory process in RA the synovial membrane gets hyperplastic, resulting eventually in the formation of a pannus tissue, which can invade into the adjacent cartilage and bone thereby destroying their integrity. Previously, the expression of ADAM15 in fibroblasts of the RA synovial membrane was found to confer a significant anti-apoptotic response upon triggering of the Fas receptor, which resulted in the activation of two survival kinases, focal adhesion kinase (FAK) and Src. The Fas receptor, also named CD95, belongs to the death receptor family of the tumor necrosis factor receptors and stimulation of Fas/CD95 by its ligand FasL results in the execution of apoptotic cell death in synovial membranes of RA patients. However, the occurrence of apoptotic cell death in vivo in RA synovial tissues is considerably low despite the presence of FasL at high concentrations in the chronically inflamed joint. Accordingly, a general apoptosis resistance is a characteristic of RA-synovial fibroblasts that contributes considerably to the formation the hyperplastic aggressive pannus tissue. The objective of this study was to investigate the mechanisms underlying the capability of ADAM15 to transform FasL-mediated death- inducing signals into pro-survival activation of Src and FAK in rheumatoid arthritis fibroblasts (RASFs). In the present study, the down-regulation of ADAM15 by RNA interference resulted in a significant increase of caspase 3/7 activity upon stimulation of the Fas receptor in RASFs. Likewise, chondrocytes expressing a deletion mutant of ADAM15 (ΔC), lacking the cytoplasmic domain, revealed increased caspase activities upon Fas ligation in comparison to cells transfected with full-length ADAM15, clearly demonstrating the importance of the cytoplasmic domain for an increased apoptosis resistance. Furthermore, activation of the Fas receptor triggered the phosphorylation of Src at Y416, which results in the active conformation of Src, as well as the phosphorylation of FAK at Y576/577 and Y861 – the target tyrosines phosphorylated by Src - in full-length ADAM15-transfected chondrocytes. However, cells transfected with ADAM15 mutant (ΔC) or with vector control did not exhibit any activation of Src and FAK upon Fas ligation. This suggested the presence of an as yet unknown protein interaction mediating the Fas triggered activation of the two kinases. In order to identify this mechanism, the application of signal transduction inhibitors interfering with Calcium signaling either by inhibiting calmodulin with trifluoperazine (TFP) or the Calcium release-activated channel (CRAC/Orai1) with BTP-2 efficiently inhibited the phosphorylation of FAK and Src, revealing a role of calmodulin, the major Ca2+ sensor in cells, in ADAM15-dependent and Fas-elicited activation of the two survival kinases. Also, a direct Ca2+ -dependent binding of calmodulin to ADAM15 could be demonstrated by pull-down assays using calmodulin-conjugated sepharose and by protein binding assays using the recombinant cytoplasmic domain of ADAM15 and calmodulin. Furthermore, it could be demonstrated in living synovial fibroblasts by double immunofluorescence stainings that triggering the Fas receptor by its ligand FasL or a Fas-activating antibody resulted in the recruitment of calmodulin to ADAM15 as well as to the Fas receptor in patch-like structures at the cell membrane. Simultaneously, Src associated with calmodulin was shown to become engaged in an ADAM15 complex, also containing cytoplasmic-bound FAK, by co-immunoprecipitations. Additional studies were performed to analyze the efficacy of TFP and BTP-2 on apoptosis induction in synovial fibroblasts from 10 RA patients. Using caspase 3/7 and annexin V stainings for determining apoptosis, it could be shown that both inhibitors did not possess any apoptosis inducing capacity. However, when co-incubated with FasL both compounds synergistically enhanced apoptosis rates in the RASFs. Moreover, an additional silencing of ADAM15 revealed a further significant rise in apoptosis rates upon incubation with FasL/TFP or FasL/BTP-2, providing unequivocal evidence for an involvement of ADAM15 in facilitating apoptosis resistance in RASFs. Taken together, these results demonstrate that ADAM15 provides a scaffold for the formation of calmodulin-dependent pro-survival signaling complexes upon CRAC/Orai1 coactivation by Fas ligation, which provides a new potential therapeutic target to break the apoptosis resistance in RASFs that critically contributes to joint destruction in RA.
• ADAM15 ist ein Transmembranprotein, das aus mehreren extrazellulären Domänen besteht, und ein Mitglied der Familie der Disintegrin Metalloproteinasen ist. Eine stark erhöhte Proteinexpression von ADAM15 ist in entzündlich-veränderten synovialen Geweben bei Erkrankungen, wie der Osteoarthrose und insbesondere der rheumatoiden Arthritis (RA), nachgewiesen worden. Im Verlauf der Entzündung wird die Synovialmembran hyperplastisch und kann zur Formation eines sogenannten Pannus führen, der den umliegende Knochen und Knorpel infiltrieren und damit zur Zerstörung dieser Gewebe führen kann. In Vorarbeiten konnte nachgewiesen werden, dass die erhöhte ADAM15 Expression in den Fibroblasten der Synovialmembran von RA-Patienten nach Stimulation des Fas Rezeptors in der Aktivierung von zwei „Überlebens-Kinasen“, der fokalen Adhesionskinase (FAK) und Src resultiert und mit einer signifikant erhöhte Apoptose-Resistenz einhergeht. Der Fas Rezeptor, Synonym: CD95, gehört zur Familie der Tumor Nekrose Faktor Rezeptoren und seine Stimulation durch den spezifischen Liganden FasL löst eine intrazelluläre Signalgebung aus, die zum apoptotischen Zelltod führt. Allerdings lassen sich Apoptosevorgänge ex vivo im RA-Synovialgewebe nur in sehr geringem Ausmaß nachweisen trotz hoher FasL-Konzentration im chronisch entzündeten Gelenkkompartiment , weshalb ein Charakteristikum von synovialen RA-Fibroblasten, ihre hohe Apoptose-Resistenz ist, die kritisch zur Ausbildung eines hyperplastischen agressiven Pannus in der RA beiträgt. Das Ziel der Arbeit war es, die grundlegenden Mechanismen einer ADAM15-mediierten Transformation von Apoptose-Stimuli ausgelöst durch Ligation des Fas Rezeptors in intrazelluläre Überlebenssignale in synovialen Fibroblasten von RA Spendern (RASFs), zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Herabregulation von ADAM15 mittels siRNAs zu einer signifikant erhöhten Caspase 3/7 Aktivität nach Stimulation des Fas Rezeptors in RASFs führt. Analog zeigen Studien an Chondrozyten, die eine Deletionsmutante ADAM15 (ΔC) mit fehlender zytoplasmatische Domäne exprimieren, nach Fas Rezeptor Aktivierung eine signifikant erhöhte Caspase 3/7 Aktivität und belegen damit die Bedeutung der zytoplasmatischen Domäne für eine gesteigerte Apoptose Resistenz. Die Stimulation des Fas Rezeptors führte in Chondrozyten nach Transfektion mit dem vollständigen ADAM15 sowohl zur Phosphorylierung von Src am Y416, was in einer aktiven Konformation von Src resultiert, als auch zur Phosphorylierung von FAK am Y576/577 und Y861, den Tyrosinresten , die von Src phosphoryliert werden. Jedoch wiesen Zellen, die mit der Deletionsmutante (ΔC) oder dem Kontroll Plasmid transfiziert waren, keinerlei Aktivierung beider Kinasen nach Fas Rezeptor Stimulation auf. Diese Ergebnisse führten zur Hypothese der funktionellen Bedeutung einer noch nicht bekannten Adaptorprotein-Interaktion in der über die Fas Rezeptor Ligation stimulierten Src and FAK Phosphorylierung. Zur Identifikation dieses Mechanismus wurden als Signaltransduktionsinhibitoren, die mit Ca2+ abhhängigen Signalen interferieren, Trifluoperazin (TFP), ein Calmodulin Inhibitor, und BTP-2, ein Inhibitor des Calcium release-activated channel (CRAC/Orai1), eingesetzt. Die Ergebnisse, die zeigen, dass die Ko-Inkubation von TFP bzw. BTP-2 mit FasL die Phosphorylierung von Src und FAK effizient inhibieren konnten, belegen die funktionelle Bedeutung von Calmodulin als Haupt-Sensor für Ca2+ Ionen, für die ADAM15-abhängige und Fas Rezeptor-mediierte Aktivierung der beiden Kinasen, Src und FAK. Zudem konnte eine direkte und Ca2+-abhängige Bindung von Calmodulin und ADAM15 sowohl mittels Pull-down Experimenten an Calmodulin-Sepharose als auch durch Protein Bindungsstudien unter Einsatz der rekombinanten zytoplasmatischen Domäne von ADAM15 und Calmodulin gezeigt werden. Doppel-Immunfluoreszenzfärbungen vitaler synovialer Fibroblasten in vitro demonstrieren, dass die Stimulation des Fas Rezeptors mit FasL oder einem Fas Rezeptor aktivierenden Antikörper zur einer Rekrutierung von Calmodulin sowohl an ADAM15 als auch an den Fas Rezeptor in „Flicken-artig“ angeordneten Strukturen an der Zellmembran führt. Zudem konnte die Bindung von Src und FAK an Calmodulin in einem Komplex mit ADAM15 nach Stimulation des Fas Rezeptors mittels Ko-immunpräzipitationen nachgewiesen werden. In zusätzlichen Untersuchungen zur Wirkung von TFP und BTP-2 auf eine Apoptose-Induktion in Synovialfibroblasten von 10 Patienten mit RA konnte mittels der Apoptose Assays einer Caspase 3/7 Bestimmung und dem immunzytologischen Nachweis von Annexin V, keine Apoptose-Induktion für beide Inhibitoren gezeigt werden. Jedoch ließ sich in Ko-inkubationen der jeweiligen Inhibitoren mit FasL eine synergistisch verstärkte Apoptose-Rate nachweisen. Darüber hinaus führte die zusätzliche Herabregulation von ADAM15 mitlels siRNAs sogar noch zu signifikanten Steigerungen der durch Inkubation mit FasL/TFP oder FasL/BTP-2 induzierten Apoptose-Raten und demonstriert damit die kritische Bedeutung von ADAM15 in der Apoptose Resistenz von rheumatoiden Synovialfibroblasten. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass ADAM15 eine wichtige Rolle als ein Adaptorprotein für die Bildung von Calmodulin abhängigen Signal-Proteinkomplexen besitzt, die nach Aktivierung des Fas Rezeptors und des damit gekoppelten Einstroms von Ca2+ Ionen durch CRAC/Orai Kanäle in einer signifikant verstärkten Transduktion von Überlebenssignalen resultiert. ADAM15 stellt damit eine neue potenzielle Zielstruktur für therapeutische Interventionen dar, um die Apoptose Resistenz von Synovialfibroblasten als einem kritischen pathogenetischen Faktor der Gelenkdestruktion in der RA zu brechen.