Open Access

Giovanni Zifarelli

• The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
• In der vorliegenden Arbeit wurde zur Untersuchung der Na, K-ATPase die Methode der ortsspezifischen Fluoreszenz-Markierung mit Tetramethylrhodaminmaleimid (TMRM) in erbindung mit der Zwei-Elektroden Spannungsklemme, kurz Spannungsklemm-Fluorometrie (voltage-clamp fluorometry, VCF), benutzt. Der TMRM-Farbstoff geht eine kovalente Bindung mit Cystein-Resten ein. Wir nutzten diese Eigenschaft um Mutanten der Na,K-ATPase zu untersuchen, denen zum einen alle natürlich vorkommenden extrazellulär zugänglichen Cysteine entfernt wurden und zum anderen Cysteine an definierten Stellen der Aminosäurekette durch Mutagenese hinzugefügt wurden. Dadurch wurde es möglich, ortsspezifische Konformationsänderungen der Natriumpumpe zeitlich aufgelöst in einer nativen Membranumgebung zu detektieren. Insbesondere erlaubt diese Technik Reaktionen zu untersuchen, die bedingt durch ihre niedrige Elektrogenizität elektrophysiologischen Methoden nicht zugänglich sind. Insbesondere wurde der Einfluss von transportierten (K+, Na+) und nicht transportierten Ionen (TEA+, NMG+, BTEA+), die aber den Transport beeinflussen, auf die spannungsabhängige Ladungsverschiebung und Fluoreszenzänderung untersucht. Für die beschriebenen Untersuchungen wurden die Mutante N790C (Schleife M5-M6) und die Mutanten E307C, T309C, L311C und E312C (Schleife M3-M4) benutzt. In Abwesenheit von extrazellulärem K+ durchläuft die Na,K-ATPase nicht den vollständigen Reaktionszxklus, da unter diesen Bedingungen die Dephosphorylierung sehr langsam verläuft. Es können deshalb die mit dem Na+-Transport assozierten E1P und E2P Übergänge isoliert untersucht werden. Für die Mutanten N790C und L311C konnte gezeigt werden, dass die Na+-Abhängigkeit von Amplitude und Kinetik des Fluoreszenzsignals, das dem E1P-E2P Übergang zugeordnet werden kann, in guter Übereinstimmung mit dem Zugangskanal-Modell ist, das einen Einfluss des elektrischen Feldes über der Membran auf die Erreichbarkeit der Na+-Bindungsstelle annimmt. Für die Mutante N790C wurde anhand substrat- und spannungsinduzierter Fluoreszenzänderungen gefunden, dass BTEA+ mit dem Na+-Zweig des Pumpzyklus interagiert. Die erhöhte Steigung der Boltzmann-Verteilung, die die Spannungsabhängigkeit des Sättigungsverhaltens des Fluoreszenzsignals beschreibt, lässt darauf schließen, dass BTEA+ die Elektrogenizität des Natriumtransports verändert. Ebenso wurde der Effekt von BTEA+ auf Kaliumtransportreaktionen untersucht. Es wurde gefunden, dass BTEA+ die durch Kalium induzierte Fluoreszenzänderung wesentlich stärker inhibiert als TEA+ und NMG+, was auf eine kompetitive Wechselwirkung zwischen K+ und BTEA+ hinweist. Die Inhibition ist dabei spannungsabhängig, was aus der Spannungsabhängigkeit der apparenten Affinität für K+ gefolgert werden kann. Ein denkbarer Mechanismus für den Einfluss von BTEA+ auf den Na+- und K+-Halbzweig des Pumpzyklus wäre, dass BTEA+ im E2P-Zustand innerhalb des transmembranären elektrischen Felds an eine Stelle nahe der K+-Bindungsstelle bindet. Dadurch würde BTEA+ den Zugang von K+ zu seiner Bindungsstelle behindern und damit einhergehend die scheinbare Affinität für K+ vermindern. In einem solchen Szenario würde die Bindung von BTEA+ ebenfalls die Rückbindung von extrazellulärem Na+ verhindern, was den Übergang E2P-E1P effektiv verlangsamen und das Enzym im E2P-Zustand arretieren würde. In Anwesenheit von K+ aber Abwesenheit von Na+ wurde in Puffern, die NMG+, TEA+ und BTEA+ enthielten, eine ausgeprägte Spannungsabhängigkeit von Amplitude und Kinetik der Fluoreszenzsignale gefunden. Dies spricht für einen elektrogenen Schritt im K+-Halbzweig des Pumpenzyklus, der selbst ratenlimitierend ist, bzw. einem ratenlimitierenden Schritt voran steht. Der elektrogene Beitrag durch die extrazelluläre Na+-Rückbindung kann in Na+-freier Lösung ausgeschlossen werden ...