Open Access

Ljuban Grgić

• Ligands of Iron-Sulphur Cluster N2: In this work the ubiquinone reducing catalytic core of NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Y. lipolytica was studied by a series of point mutations replacing conserved histidines or arginines in the 49-kDa subunit. Although the missing 4th ligand of cluster N2 could not be found in the 49-kDa subunit of complex I, it was clearly demonstrated that iron-sulphur cluster N2 resides directly on the interface between the PSST and 49-kDa subunits. The results presented in this work show that residues in the 49-kDa subunit have strong influence on this redox centre and also on catalytic activity. The strong influence of Arg-141 and His-226 residues in 49-kDa subunit on this cluster can be deducted from complete loss of N2 signals in EPR spectra such as in case of mutants H226A and R141A. In the case of mutant H226M the EPR signal from cluster N2 was shifted and cluster N2 even lost the pH dependence of its redox midpoint potential and became more similar to the other so called 'isopotential' clusters. Specifically in the case of mutants R141M and R141K the characteristic signature of cluster N2 became undetectable in EPR spectra. However, specific dNADH:DBQ oxidoreductase activity that could be inhibited with the specific complex I inhibitors DQA and rotenone was not absolutely abolished but rather reduced. These reductions in complex I activity did not correspond to similar reductions in the specific EPR signal of cluster N2 as it was observed in the His-226 mutant series. No indications could be found that these mutations had modified the magnetic properties of cluster N2, resulting in different EPR spectra. From these observations it could be concluded that both mutants R141K and R141M virtually or entirely lack iron-sulphur cluster N2. The rates in complex I activity could be reconciled with electron transfer theory: After removal of a single redox centre in a chain, electron transfer rates are predicted to be still much faster than steady-state turnover of complex I. These results from mutants R141K, R141M and also the result from mutant H226M that protons are being pumped even if the redox midpoint potential of cluster N2 is not pH dependent questions the prominent role in the catalytic mechanism of complex I that has been ascribed to cluster N2. Histidine 91 and 95 were found to be absolutely essential for activity of complex I since in both mutants complex I was fully assembled and artificial NADH:HAR activity was parental whereas complex I specific dNADH:DBQ activity was abolished. The signal from cluster N2 in EPR spectra was parental for all His-91 and -95 mutants. Mutations at the C-terminal arginine 466 affected ubiquinone affinity and inhibitor sensitivity but also destabilised complex I. All these results provide further support for a high degree of structural conservation between the 49-kDa subunit of complex I and the large subunit of water soluble [NiFe] hydrogenases. Remodelling of Human Pathogenic 49-kDa Mutations in Y. lipolytica: Y. lipolytica has been proven a good system for studying complex I properties and thus also for studying defects that occur in humans. In this work pathogenic mutations in the 49-kDa subunit of complex I were recreated and studied. The P232Q mutant showed non-assembly of complex I and this is probably the cause why this mutation was lethal in patients. The mutants R231Q and S416P were parental for the content, artificial and also specific complex I activity, Km for DBQ and IC50 for DQA. From these results we can conclude that these two residues Arg-228 and Ser-413 in mammalian cells have specific structural importance for the 49-kDa subunit even if they are not directly involved in catalytic process.
• Die mitochondriale Atmungskette besteht aus vier Multiproteinkomplexen (Komplex I, NADH:Ubichinon Oxidoreduktase; Komplex II, Succinat:Ubichinon Oxidoreduktase; Komplex III, Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase auch bc1 Komplex genannt; Komplex IV, Cytochrom c:O2 Oxidoreductase, auch Cytochrom c Oxidase genannt). Die Elektronen der Reduktionsäquivalente NADH und FADH2, die hauptsächlich in der Glykolyse, der Fettsäureoxidation und dem Citratcyclus gebildet werden, geben ihre Elektronen an die Atmungskette ab, wobei molekularer Sauerstoff als terminaler Akzeptor dient. Die durch diesen Elektronentransport freiwerdende Energie wird in der Form eines Protonengradients gespeichert. Der so aufgebaute elektrochemische Gradient wird zur Synthese von ATP genutzt. Die Kopplung des Elektronentransports durch die Atmungskettenkomplexe und der ATP Synthese durch die ATP-Synthase wird "oxidative Phosphorylierung" genannt. Dieses Prinzip der Energieumwandlung wurde von P. Mitchell als chemiosmotische-Hypothese vorgeschlagen (Mitchell, 1961). Komplex I ist der größte und am wenigsten untersuchte transmembrane Proteinkomplex der Atmungskette. Elektonenmikroskopische Untersuchungen am Komplex I aus verschiedenen Organismen haben einen L-förmige Struktur für sowohl prokaryotischen also auch eukaryotischen Komplex I gezeigt (Y. lipolytica, Djafarzadeh et al., 2000; N. crassa, Guenebaut et al., 1997; E. coli, Guenebaut et al., 1998; Bos taurus Herz, Grigorieff, 1998)). Der Komplex I aus Säugetieren besteht aus 46 Untereinheiten (Carroll et al., 2003; Skehel et al., 1998). Der prokaryotische Komplex I besteht aus 14, den so genanten "zentralen", Untereinheiten (in E. coli 13, da die 49-kDa und die 30-kDa Untereinheit fusioniert sind). Alle diese 14 prokaryotischen Untereinheiten sind auch bei Säugetieren vorhanden, 7 von ihnen werden von mitochondrialer DNA kodiert. In den letzten Jahren wurde Yarrowia lipolytica, eine obligat aerobe Hefe, als Modellsystem etabliert. Die Atmungskette der Hefe S. cerevisiae beinhaltet keinen Komplex I. Y. lipolytica hat dagegen einen stabilen Komplex I der sich gut reinigen lässt und dem Komplex aus N. crassa sehr ähnelt. All dies macht diese Hefe zu einem hervorragenden Modellsystem für strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Komplex I (Kerscher et al., 2002). Aufgrund der Ergebnisse einer zielgerichteten Mutagenese in Y. lipolytica wurde vorgeschlagen, dass das katalytische Zentrum des Komplex I während der Evolution aus dem aktiven Zentrum der [NiFe] Hydrogenase entstanden ist und sich wahrscheinlich an der Grenzfläche zwischen den PSST und 49-kDa Untereinheiten befindet (Kashani-Poor et al., 2001b; Garofano et al., 2003). Die 49-kDa Untereinheit ist homolog zu der großen und die PSST zu der kleinen Untereinheit der bakteriellen wasserlöslichen [NiFe] Hydrogenasen (Böhm et al., 1990; Albracht, 1994). Die Kristallstruktur dieser wasserlöslichen [NiFe] Hydrogenasen wurde aufgelöst (Volbeda et al., 1995; Montet et al., 1997). Es wurde auch vorgeschlagen, dass das proximale Eisen-Schwefel Zentrum aus diesen wasserlöslichen [NiFe] Hydrogenasen sich zum Eisen-Schwefel Zentrum N2 entwickelte. In allen bekannten Sequenzen der PSST Untereinheit findet man 4 konservierte Cysteinreste, aber nur 3 von diesen können als Liganden des Zentrums N2 dienen. Da zwei Cysteine direkt benachbart sind, können beide aus energetischen Gründen nicht gleichzeitig Liganden des N2 Zentrums sein. Laut Flemming et al., (2003) wird diese Ansicht nicht geteilt. Nach unserem Strukturmodell befindet sich das Eisen-Schwefel Zentrum N2 an der Grenzfläche zwischen der PSST und der 49-kDa Untereinheit und es wäre durchaus möglich, dass ein Rest der 49-kDa Untereinheit als 4ter Ligand des Zentrums N2 dient. Um diese Hypothese zu testen wurden Histidine und Arginine, die in Komplex I-Sequenzen aus verschiedenen Organismen oder in Komplex I und [NiFe] Hydrogenasen konserviert sind, mutagenisiert. Histidin 226 ist in allen bis jetzt bekannten Komplex I Sequenzen konserviert und entspricht einem hoch konservierten Histidin aus wasserlöslichen [NiFe] Hydrogenasen. In [NiFe] Hydrogenasen bildet dieser Histidinrest eine Wasserstoffbrücke zu dem proximalen Eisen-Schwefel Zentrum. His-226 wurde in Alanin und in die potentiellen Eisen-Schwefel Cluster Liganden Glutamin, Cystein und Methionin ummutiert. Alle Mutanten dieses Restes hatten einen assemblierten Komplex I. Die Mutante H226A hatte um 80 % reduzierte Komplex I Aktivität. Die Mutanten H226C und H226Q hatten noch ca. 50 % Komplex I Aktivität. Die Aktivität der Mutante H226M war nur um 20 % reduziert. Zur genaueren Ansicht der proteinchemischen Daten siehe Table 3.1. EPR Spektren sowohl aus mitochondrialen Membranen als auch aus isoliertem Komplex I zeigten einen Einfluss auf das Signal des Zentrums N2, wobei die Signale der anderen Eisen-Schwefeln Zentren unverändert blieben. Das EPR Spektrum der Mutante H226A zeigte kein N2 Signal. Die EPR Signale der übrigen Eisen-Schwefeln Zentren waren unverändert. EPR Spektren, die unter vielen verschiedenen Bedingungen aufgenommen wurden (Temperatur, Mikrowellen-Stärke und Feldbereich) ergaben keine Hinweise auf neue paramagnetische Spezies. Die Schlussfolgerung aus diesen Experimenten ist, dass Cluster N2 in der Mutante H226A nicht nur in seinen Eigenschaften verändert ist, sondern tatsächlich fehlt. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in den EPR Spektren der Mutanten H226Q und H226C beobachtet, wobei die Intensität des N2 Zentrums in diesen Fällen zwar deutlich geringer war als im wildtypischen Enzym (Figure 3.4) aber nicht völlig fehlte. Interessanterweise war in den Spektren aus Mutante H226M nicht nur das N2 Signal geringer, sondern auch noch zu kleineren magnetischen Feldstärken verschoben. Arginin 141 ist in allen bis jetzt bekannten Komplex I Sequenzen konserviert und entspricht einem hoch konservierten Arginin aus wasserlöslichen [NiFe] Hydrogenasen. Im Hydrogenase-Strukturmodell befindet sich dieser Rest sehr nah am Zentrum N2. Der Arg-141 Rest wurde in Alanin, Lysin und Methionin ummutiert. Alle Arg-141 Mutanten hatten einen assemblierten Komplex I. Die Mutante R141A hatte keine hemmbare Komplex I Aktivität, wobei die Mutanten R141K und R141M eine um ca. 50% (unterschiedlich für verschiedene Präparationen insbesondere bei Mutante R141K) reduzierte Aktivität zeigten. Es wurde ein signifikanter Unterschied zwischen EPR Spektren und Aktivitäten beobachtet. Die Komplex I Aktivität war in der Mutante R141M vermindert, wobei das EPR Signal für das Zentrum N2 weder in mitochondrialen Membranen noch im isolierten Enzym nicht detektiert werden konnte. In der Mutante R141K wurde in isoliertem Enzym weniger als 5 % der wildtypischen N2 Intensität beobachtet, und außerdem scheint das gz Signal des Zentrums N2 verschoben zu sein. Eine wahrscheinliche Interpretation für dieses erstaunliche Ergebnis von Elektronentransport trotz fehlendem Eisen-Schwefel Cluster N2 könnte man anhand der Elektronentransport-Theorie ableiten. Der 'Dutton-Moser-Ruler' gibt die Abhängigkeit zwischen der Reaktionsrate und dem Abstand von benachbarten Redox-Zentren an (Page et al., 1999). Normalerweise beträgt der Abstand zwischen benachbarten Redox-Zentren, in unserem Fall Eisen-Schwefel-Cluster, in einem Protein um 5 Å (Volbeda et al., 1995; Montet et al., 1997). Die Reaktionsrate beträgt 1011 s-1 bei 5 Å Abstand. Falls eines der Redox-Zentren fehlt, würde der Abstand ca. 10 Å betragen und die Rate wäre entsprechend um 2-3 Größenordnungen geringer (108-109 s-1). Im Vergleich zur Wechselzahl von Kompex I, die um 102 s-1 beträgt, sollte ein Ausfallen von einem der Redox-Zentren keinen gravierenden Effekt auf die Wechselzahl ausüben. Histidin 91 und 95 sind hoch konserviert in Komplex I Sequenzen aus verschiedenen Organismen aber sind nicht konserviert in [NiFe] Hydrogenasen. Wenn man annimmt, dass die Proteinfaltung während der Evolution erhalten blieb, liegn diese beiden Histidinreste in der Nähe von Zentrum N2. His-91 und -95 wurden in Alanin, Methionin und Arginin ummutiert. Alle Mutanten dieser beiden Histidine 91 und 95 hatten einen assemblierten Komplex I, aber keine von ihnen zeigte Komplex I Aktivität, auch nicht bei einer sehr konservativen Mutation (Histidin zu Arginin). Die EPR Spektren von mitochondrialen Membranen der His-91 und His-95 Mutanten und auch von isoliertem Enzym der Mutante H95A waren wildtypisch. Der C-terminale Argininrest 466 ist hoch konserviert in Komplex I und entspricht in wasserlöslichen [NiFe] Hydrogenasen einem hoch konservierten Histidinrest, der dem Mg2+ Zentrum als Ligand dient. Der Argininrest wurde in Alanin, Methionin, Histidin und Glutamat ummutiert. Alle Arg-466 Mutanten außer R466H hatten einen stark reduzierten Gehalt (30-50 %) an Komplex I. Normalerweise deutet dies auf strukturelle Instabilität hin. Dadurch war es auch nicht möglich, Komplex I zu isolieren um ein EPR Spektrum aufzunehmen. Die Komplex I Aktivität war im Fall von R466M stark reduziert auf 20 % der wildtypischen Aktivität, während die Mutanten R466A und R466H eine Aktivität von 80 % und R466E von 50 % hatten (Table 3.7). Einer der wichtigsten Ansätze in dieser Arbeit war zu testen, ob einer dieser untersuchten Reste als 4ter Ligand des Eisen-Schwefel Zentrums N2 dienen könnte. His-91 und His-95 kann man mit sehr großer Sicherheit als 4ten Ligand ausschließen, da nach dem Austausch des Histidinrestes gegen ein Alanin das EPR Spektrum wildtypisch blieb. Arg-466 kann man ebenso ausschließen, denn sogar bei so einem geringen Gehalt an Komplex I wie in den Mutanten R466A und R466M konnte man typische Merkmale des N2 Zentrums in der gxy Region des EPR Spektrums erkennen. Spezifische und außergewöhnlich parallele Effekte auf das Zentrum N2 ergaben die Mutationen von Arg-141 und His-226 (siehe Figure 3.4 und Figure 3.12). Bei Umtausch in einen Alaninrest, der klein und hydrophob ist, konnte kein N2 Signal im EPR nachgewiesen werden. Bei einem konservativen Umtausch (R141K und H226M) wurde die Intensität des EPR Signals für das Zentrum N2 geringer und zu einer niedrigeren Feldregion verschoben. Andere Mutationen zeigten drastische Effekte auf das Zentrum N2, in H226C und H226Q wurde das Signal sehr stark reduziert und im Fall von R141M verschwand es ganz. Resultierend aus diesen Ergebnissen könnte man schließen, dass einer der beiden Resten der 4te Ligand des Zentrums N2 wäre. Das ähnliche Verhalten des Zentrums N2 bei Mutationen der beiden Reste R141 und H226 deutet jedoch mehr auf eine Änderung in der nahen Umgebung des Zentrums N2 und nicht auf einem Ligandenumtausch. Im Vergleich zu R466, wo globale Destabilisierung eintritt, wirkt der Umtausch von H226 und R141 mehr auf lokaler Ebene, insbesondere auf das Zentrum N2. Obwohl der 4te Ligand in dieser Arbeit nicht identifiziert werden konnte, spielen die beiden Reste R141 und H226 eine wichtige Rolle im katalytischen Prozess. Dies ist besonderes anschaulich in der Mutante H226M, wo das Redox-Mittelpunktspotential von N2 um mehr als 70 mV positiver ist (Figure 3.6). Auch die Abhängigkeit vom pH-Wert war nicht mehr vorhanden (Figure 3.7). Aber das Maximum der Enzymaktivität in Abhängigkeit von pH Wert war in der Mutante H226M wildtypisch. Das isolierte Enzym aus H226M konnte auch in Anwesenheit von Asolectin reaktiviert werden. Die Proteoliposomen der Mutante H226M konnten Protonen gleichermaßen wie der Wildtyp pumpen. Aus diesen Experimenten konnte man jedoch nur qualitative Schlüsse ziehen. Die genauere H+/e- Stöchiometrie konnte man dabei nicht feststellen. Dem Zentrum N2 wird eine wichtige Rolle zugeschrieben, es soll die Protonenpumpe von Komplex I mit der Reduktion von Ubichinon koppeln. Nach den hier präsentierten Ergebnissen wird die Rolle des Zentrums N2 in Frage gestellt. Denn die Mutante R141M hatte eine stark ausgeprägte, mit Komplex I spezifischen Inhibitoren hemmbare Aktivität, jedoch wurde kein N2 Signal in der EPR Spektroskopie detektiert. Noch dazu pumpt die Mutante H226M Protonen gleichermaßen wie der Wildtyp, wobei keine pH Abhängigkeit des Mittelpunktspotentials zu beobachten war. Dabei stellt sich auch die Frage auf welche Weise die Protonenpumpe in Komplex I funktioniert: Ist es eine Redox-Pumpe, eine mechanische Pumpe (Konformationsänderung) oder sogar eine Kombination aus beiden Typen? Außerdem ist die Rolle vom Cluster N2 in der Protontranslokation zu klären. Dafür sind weitere Untersuchungen an dem wildtypischen Komplex I und an den Mutanten H226M, R141M und R141K geplant. Neben dem großen akademischen Interesse am Mechanismus von Komplex I spielt dieses sehr wenig verstandene und komplizierte Enzym wegen seines Zusammenhangs mit einer Vielzahl von Krankheiten eine wichtige Rolle in der Humanmedizin (Robinson, 1998; Loeffen et al., 2000; Gluck et al., 1994). Außerdem wird Komplex I als eine der Hauptquellen der ROS (Reactive Oxygen Species) diskutiert (Wallace, 1999; Sherer et al., 2003). In dieser Arbeit wurden drei Mutationen (R231Q, P232Q und S416P, Y. lipolytica Nummerierung), die für Menschen pathogen sind, in der 49-kDa Untereinheit reproduziert. Die Mutanten R231Q und S416P zeigten keinen Einfluss auf die Enzymaktivität oder auf den Km für DBQ und vmax für DBQ. In der Mutante P232Q wurde Komplex I nicht assembliert. In dieser Mutante ist wahrscheinlich die nicht richtige Proteinfaltung für das Krankheitsbild verantwortlich. Aus den Untersuchungen an Mutanten R231Q oder S416P kann man abschließend nicht sagen, warum diese Mutationen pathogen sind. Drastischere Mutationen an diesen beiden Positionen, R231E und S416A ergaben jedoch Effekte auf das katalytische Zentrum, der Km Werte für DBQ waren im Fall von R231E mehr als 2fach und in S416A mehr als 3fach höher (Table 3.9). Dies ist im Einklang mit dem [NiFe] Hydrogenase Strukturmodell und auch ein Hinweis auf räumliche Nähe dieser Reste zum Chinon-Reduktionszentrum. Die Untersuchungen an lebenden Zellen haben gezeigt, dass Mitochondrien nicht einzelne isolierte Organellen darstellen, sondern in Form eines zusammenhängenden Netzwerks organisiert sind. Die Mutation R231Q verursacht bei Menschen eine Fragmentierung des mitochondrialen Netzwerk. Um zu überprüfen, ob dies auch in der Hefe vorkommt, wurde eYFP (eine Variante von GFP, Green Fluorescent Protein) mitochondrial exprimiert. Das Gen für die 30-kDa Untereinheit wurde C-terminal mit dem eYFP-Gen fusioniert. Es wurde beobachtet, dass die Mitochondrien sich in der Nähe der Zellwand befinden. In vorläufigen Untersuchungen der Mutante R231Q wurden keine Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp beobachtet. Aber dies muss noch genauer in Kooperation mit Prof. Smeitink von NCMD (Die Niederlande) untersucht werden.