Untersuchungen zur Aktivität eines Trockenstress- und Abscisinsäure-induzierbaren Promotors aus der Wiederauferstehungspflanze <i>Craterostigma plantagineum</i> und Isolierung von DNA-Bindeproteinen

Abstract

Die Wiederauferstehungspflanze <i>Craterostigma plantagineum</i> dient als Modellsystem zur Erforschung der physiologischen Antwort auf Trockenstress. Im Verlauf der Austrocknung leitet dieser Organismus zahlreiche Schutzmaßnahmen ein, die es ihm ermöglichen, ein vollständiges Austrocknen unbeschadet zu überstehen. Dazu gehört auch die Akkumulation des LEA-Proteins C2, das in hohem Maße bei Trockenstress und nach Applikation des Phytohormons Abscisinsäure (ABA) exprimiert wird. <br /> Im ersten Teil der Arbeit erfolgt die Charakterisierung des C2-Promotors. Anhand verschiedener C2-Promotor::GUS-Fusionen wurden regulatorisch funktionelle Motive identifiziert, darunter zwei ABA-responsive Elemente (ABRE) und eine Bindestelle für einen HDZip-Transkriptionsfaktor.<br /> Um mögliche Bindeproteine zu isolieren, dienten diese cis-aktiven Elemente im zweiten Teil als Ziel-DNA für einen Hefe One-Hybrid-Screen. Dabei wurden mehrfach unabhängig voneinander die cDNAs von einem bZip-Transkriptionsfaktor der Gruppe S und von drei hoch konservierten Histon H3-Proteinen isoliert. Bei zwei der drei abgeleiteten Histon-Proteine handelt es sich um konstitutiv exprimierte Varianten, die Zellzyklus-unabhängig reguliert werden und sehr wahrscheinlich eine Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen. Das bZip-Protein weist die größten Homologien zu zwei bZip-Proteinen aus <i>Antirrhinum majus</i> auf, deren Bindestelle den beiden ABA-Response-Elementen im C2-Promotor stark ähnelt. Die Bildung des bZip-Transkripts erfolgt konstitutiv, es gibt aber Hinweise auf eine mögliche post-transkriptionelle Regulation. <br /> Ebenso wie die Histone ist auch bZip Mitglied einer kleinen Genfamilie. Anhand von GFP-Fusionskonstrukten konnte nachgewiesen werden, dass sowohl Histon H3 als auch das bZip-Protein im Nukleus exprimiert werden. Bindungsstudien zeigen, dass die Histon-Variante und das bZip-Protein an den C2-Promotor binden. Aber Co-Transformationen von CaMV 35S::bZip- und C2-Promotor::GUS-Konstrukten konnten bisher kein transaktivierendes Potential von bZip alleine nachweisen. Möglicherweise ist der dazu benötigte Dimerisierungspartner noch nicht identifiziert.

<b>Molecular analysis of a dehydration and abscisic acid inducible promoter isolated from the resurrection plant <i>Craterostigma plantagineum</i> and identification of DNA binding proteins</b><br /> The resurrection plant <i>Craterostigma plantagineum</i> serves as a model system for the research concerning the physiological answer to drought stress. During dehydration Craterostigma expresses a large number of protection mechanisms which enable this plant to survive severe water loss. One of these mechanisms is the accumulation of the LEA protein C2 which is expressed in a high abundancy at drought stress conditions and after the application of the phytohormone abscisic acid (ABA). <br /> The first part of this work deals with the characterization of the C2-promoter. By constructing various C2-promoter::GUS-fusions regulatory cis-acting motifs were identified including two ABA-responsive elements (ABRE) and a binding site for a HDZip transcription factor. In order to isolate binding proteins these cis-acting motifs served as a target-DNA for a yeast one-hybrid screen which is described in the second part of this work.<br /> The screen led to the isolation of a bZip transcription factor and three highly conserved histone H3 proteins. Two of these histone H3 proteins are constitutively expressed histone H3 variants which are regulated independently from the cell cycle and might function in gene regulation. The bZip protein shows homologies to two bZip proteins from <i>Antirrhinum majus</i>, the binding site of which is very similar to the two ABA-responsive elements in the C2-promoter. The bZip transcript is constitutively transcribed, but there are hints for a potential post-transcripional regulatory mechanism. <br /> Like the histones, bZip is a member of a small gene family. By constructing GFP-fusions it was shown that histone H3 as well as the bZip protein are expressed in the nucleus. EMSA studies showed the binding of the histone-variant and the bZip protein to the C2-promoter. <br /> However, the co-transformation of CaMV 35S::bZip and C2-promoter::GUS-constructs did not lead to C2-transactivation. Perhaps the required dimer partner has not been identified so far.