Kooperative Interaktionen an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren

Abstract

Muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren weisen neben der orthosterischen Bindungsstelle eine zweite, allosterische, Bindungsstelle auf. Alle fünf Muskarin-Rezeptor-Subtypen können allosterisch moduliert werden. Interessanterweise zeigen fast alle bekannten allosterischen Modulatoren die höchste Affinität zum M₂-Rezeptor-Subtyp und die niedrigste Affinität zum M₅-Rezeptor-Subtyp. <br /> Für allosterische Modulatoren vom Alkan-Bisammonium-Typ (zum Beispiel W84 und Dimethyl-W84) und allosterische Liganden aus der Gruppe der Caracurin V Derivate (darunter Diallylcaracurin V) sind bislang zwei Epitope identifiziert worden, die für die M₂/M₅-Selektivität an NMS-besetzten Rezeptoren verantwortlich sind: eine einzelne Aminosäure am Beginn der siebenten transmembranären Domäne, M₂⁴²³Thr (Buller et al., Mol Pharmacol, 61:160-168), und eine Sequenz aus sechs Aminosäuren, M₂^172-177Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr, im Bereich der zweiten extrazellulären Schleife (Buller, Dissertationsschrift, Math.-Nat. Fakultät, Universität Bonn, 2002) des M₂-Rezeptors. <br /> Ziel dieser Arbeit war die Eingrenzung des Epitopes aus sechs Aminosäuren in der zweiten extrazellulären Schleife auf möglichst eine einzelne Aminosäure. <br /> Dazu wurden M₂/M₅-chimäre Punktmutanten hergestellt und zusammen mit M₂- und M₅-Wildtyp-Rezeptoren transient in COS 7-Zellen exprimiert. Die Bestimmung der Affinität des jeweiligen allosterischen Modulators zum entsprechenden Wildtyp-Rezeptor bzw. Rezeptormutante erfolgte in kinetischen Bindungsstudien in Form von Dissoziationsexperimenten mit dem orthosterischen Radioliganden [³H]N-Methylscopolamin ([³H]NMS). Der Vorteil dieser Experimente am [³H]NMS-besetzten Rezeptor bestand in ausschließlicher Beobachtung allosterisch vermittelter Effekte. Die konzentrationsabhängigen Effekte des allosterischen Modulators auf die [³H]NMS-Dissoziation spiegelten dessen Besetzung der allosterischen Bindungsstelle und damit dessen Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor wider. <br /> Mithilfe der M₂/M₅-chimären Punktmutanten konnte M₂¹⁷⁷Tyrosin als relevante Aminosäure innerhalb der M₂^172-177Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Sequenz in der zweiten extrazellulären Schleife identifiziert werden. <br /> Um zu prüfen, ob M₂¹⁷⁷Tyrosin und M₂⁴²³Threonin allein die M₂/M₅-Selektivität der untersuchten allosterischen Modulatoren bedingen, wurde eine Doppelmutante hergestellt, in der sowohl die bereits als essentiell identifizierte Aminosäure M₂⁴²³Threonin als auch die gerade identifizierte Aminosäure M₂¹⁷⁷Tyrosin zu den korrespondierenden Aminosäuren des M₅-Rezeptors, His und Gln, mutiert wurden. Durch die Untersuchungen an der Doppelmutante wurde bestätigt, dass M₂¹⁷⁷Tyrosin zusammen mit M₂⁴²³Threonin die M₂/M₅-Selektivität der untersuchten allosterischen Modulatoren an NMS-besetzten Rezeptoren vollständig erklärt. <br /> An die Untersuchungen zur Epitopabhängigkeit der allosterischen Modulatoren an NMS-besetzten Rezeptoren schlossen sich Experimente an freien Rezeptoren an. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass M₂¹⁷⁷Tyrosin im Gegensatz zu M₂⁴²³Threonin am freien Rezeptor kaum ein Rolle für die Affinität der allosterischen Modulatoren spielt. Die M₂/M₅-Selektivität der allosterischen Modulatoren an freien Rezeptoren konnte nicht vollständig durch diese beiden Aminosäuren erklärt werden. Ein zusätzliches, noch unbekanntes Epitop des M₂-Rezeptors, das am NMS-besetzten Rezeptor nicht zur Alloster-Bindung beiträgt, ist sehr wahrscheinlich für die Affinität der allosterischen Modulatoren an freien M₂-Rezeptoren mit verantwortlich.