Analyse der Thermostabilität mitochondrialer Proteine anhand der Protein-Disaggregation durch Hsp78 in Bäckerhefe

Abstract

Alle Organismen zeichnen sich durch spezifische auf ihre Lebensbedingungen angepasste Charakteristika aus. Hefen, darunter auch die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, besitzt eine Vielzahl an spezialisierten Proteinen, welche ihnen das Leben unter den gegebenen Bedingungen ermöglichen. Ein wesentlicher Faktor dabei ist die Erhaltung der Proteinhomöostase. Bei der Untersuchung von Hitzeschockproteinen ist das in Mitochondrien vorkommende Hitzeschockprotein 78 (Hsp78), welches der Hitzeschockprotein 100 (Hsp100) Familie angehört, als eine Art mitochondrialer Sonderfall identifiziert worden. <br /> Dieses besitzt im Gegensatz zu anderen Proteinen keinen Homolog in humanen Organismen. Die Untersuchung dieses Proteins, seiner Bedeutung und Funktion sind deshalb von speziellem Interesse, um mögliche unbekannte Protein-protektive Mechanismen in Mitochondrien zu identifizieren. Grundsätzlich ist bekannt, dass Hsp78 in der Lage ist unter Hitzeeinfluss aggregierte Proteine wieder aufzulösen, um deren Abbau oder eine Rückfaltung in ihre funktionelle Form zu begünstigen. Hierbei wurden bereits einige Substrate identifiziert, jedoch noch keine Hsp78-basierte Proteomstudie in Mitochondrien durchgeführt. <br /> Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, welche mitochondrialen Proteine grundsätzlich eine Thermosensitivtät aufzeigen und welche mitochondrialen Funktionen und die damit verbundenen Proteine von einer Bindung an das Hsp78-Chaperon beeinflusst werden? Hierbei sollten weitere Hsp78-Substrate identifiziert und der intramitochondriale Einfluss des Chaperons definiert werden. Experimentell wird dabei in Anlehnung an andere Hsp100 Substratstudien auf eine Mutante mit defizienter ATPase-Funktion zurückgegriffen. <br /> Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese neue Hsp78-Mutante als hsp78TR bezeichnet und zuerst im Vergleich mit dem Wildtyp charakterisiert. Hierbei zeigte sich für die Mutante ein ATPase-Aktivitätsverlust mit veränderten Komplexbildungs- und Substratbindungseigenschaften. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde diese in Experimenten mit stabiler Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur (engl.: stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC)) für die Koaufreinigung mit anschließender massenspektrometrischer (MS) Analyse eingesetzt. Des Weiteren wurden in einem in organello Aufbau, thermo-sensitive mitochondriale Proteine und mögliche Hsp78-Substrate über eine aktive Auflösung hitzeinduzierter Aggregate bestimmt. Abschließend wurden beide MS-Datensätze bioinformatisch zusammengeführt und ein deutlicher Einfluss des Hsp78-Chaperons auf eine Vielzahl wichtiger mitochondrialer Funktionen aufgezeigt. Besonders auffallend war die Aggregation von Proteinen, welche Bindungsreaktionen vermitteln. Darüber hinaus zeigt das mitochondriale Proteom eine starke Beeinträchtigung durch Hitzestress bei der mitochondrialen Translation. In diesem Zusammenhang scheint Hsp78 ein zentraler Faktor bei der Reaktivierung translationaler Komponenten zu sein und darüber hinaus auch andere Funktionen wie die Energieproduktion und den Aminosäuremetabolismus stark zu beeinflussen. Die gewonnen Informationen könnten zukünftig dafür genutzt werden, das Aggreationsverhalten von anderen Proteinen zu erforschen oder um die Kapazität bzw. Effizienz von anderen Disaggregasen zu beeinflussen. <br /> Bei der Untersuchung der Rolle von Hsp78 in der Reaktivierung von mitochondrialen Komponenten nach Hitzestress wurde Ssc1 als wichtiges Substrat bestätigt. Gleichzeitig wird vermutet, dass das Hsp70 Chaperon auch als funktioneller Interaktionspartner bei der Stimulation der ATPase-Aktivität von Hsp78 fungiert, während es grundsätzlich als wichtige Komponente der Importmaschinerie Membran-gebunden arbeitet. Um die hohe funktionelle Diversität von Ssc1 zu beleuchten wurden potentielle posttranslationale Modifikationen des Proteins mittels verschiedener experimenteller Ansätze untersucht.

Organisms exhibit specific characteristics making them suitable for their given environmental conditions. Thus yeast cells including bakers yeast Saccharomyces cerevisiae owe a multitude of specialised proteins maintaining protein homeostasis and making survival possible under given circumstances. A group of these specialised proteins is represented by the heat shock protein family. <br /> Analysing heat shock proteins, the yeast mitochondrial Hsp100 family protein Hsp78 seems to have a notable role since it has no homologue in human mitochondria. Therefore the investigation of its impact and function could lead to the discovery of an unknown proteoprotective mechanism for the mitochondrial organelle. In principle it is known that Hsp78 is in charge of the resolubilisation of aggregated proteins after heat stress, thereby supporting refolding of substrates into their native structure or subsequent degradation. Up to date some single substrates have been identified, but no Hsp78-based proteomic analysis has been performed. <br /> From this point of view the present thesis aims on the identification of proteins that have a tendency to aggregate under thermal stress and which individual proteins are being influenced by Hsp78 chaperone binding? In this regard Hsp78 substrates were identified and the characterisation of its functional impact inside mitochondria was investigated. The experimental approach refers to other Hsp100 substrate studies including ATPase-deficient mutants of the target chaperone. <br /> In the context of this study this new Hsp78 ATPase-deficient mutant was termed hsp78TR and was characterised in contrast to its equivalent wildtype. The mutant is showing a strongly impaired ATPase activity with altered complex formation and substrate binding attributes. In the further process of this work the mutant was utilised in stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) based copurification experiments with adjacent mass spectrometric measurements (MS). In addition an in organello setup was used to identify thermo-sensitive mitochondrial proteins and potential Hsp78 substrates being actively resolubilised from heat induced aggregate pellets. In conclusion both MS-datasets were bioinformatically consolidated in order to present the overall impact of Hsp78 for mitochondrial functionality. Data analysis revealed aggregation tendency for proteins being involved in different types of binding reactions as well as a statistically significant impairment for components of the mitochondrial translation machinery. In this regard Hsp78 seems to be a key factor for the reactivation of mitochondrial translation after heat stress while also having strong impact on energy production and amino acid metabolism. The obtained information could be used for the further investigation of protein aggregation processes or to control the capacity and efficiency of other protein disaggregases. <br /> Analysing the role of Hsp78 in the reactivation of mitochondrial components after heat stress, Ssc1 was found to be major substrate. While it is supposed that Ssc1 could be an important Hsp78 interaction partner stimulating its ATPase activity, it is known to be a key player of the mitochondrial import machinery. In order to elucidate this functional diversity the analysis of potential posttranslational modifications of Ssc1 by different experimental approaches was performed.