Identifizierung und Charakterisierung der ultrastrukturellen Alterationen myokardialer Mitochondrien

Bis heute stellen die kardiovaskulären Erkrankungen eine der häufigsten Morbiditäts- und Mortalitätsfaktoren in unserer Gesellschaft dar und sind mit der Dysfunktion und Schädigung von Mitochondrien assoziiert. Das Herz benötigt für seine enorme Pumpleistung viel Energie in Form von ATP, das durch zahlreiche Mitochondrien in den Kardiomyozyten produziert wird. Neben dieser Hauptfunktion spielen Mitochondrien aber auch eine wichtige Rolle beim Zelluntergang. So beruht z.B. beim akuten Myokardinfarkt die Gewebsschädigung nicht allein auf der Ischämie, sondern auch auf der lebensnotwendigen Reperfusion des Gewebes, dem sogenannten I/R-Schaden, bei dem die Mitochondrien durch Porenbildung (MOMP oder mPTP) unter Beteiligung der BCL-2 Proteine BNIP3 und BAX geschädigt werden und den apoptotischen und nekrotischen Zelluntergang der Kardiomyozyten determinieren. Auch Veränderungen der Mitochondrienmorphologie, einschließlich ihrer Größe, Volumen, Form, Anzahl, Verteilung und Cristae-Struktur wurden in unterschiedlichen kardiovaskulären Erkrankungen beobachtet und beschrieben. Unter physiologischen Bedingungen bleibt die strukturelle und funktionelle Integrität der Mitochondrien durch Fissions-/Fusionsprozesse und Mitophagie erhalten. Auch hier wird eine Beteiligung von BNIP3 diskutiert. Studien zur mitochondrialen Dynamik zeigten, dass eine Beeinflussung im Fissions-/Fusionsprozess eine massive mitochondriale Akkumulation in Kardiomyozyten hervorruft, die mit einer Verzerrung der Sarkomerstruktur einhergeht. Zur eindeutigen qualitativen und quantitativen Charakterisierung der morphologischen Alterationen von Mitochondrien ist eine präzise und reproduzierbare Bildaufnahme und Analyse im Nanobereich unabdingbar. Die meisten Studien verwenden routinemäßig eine 2D-Transmissionselektronenmikroskopie, die jedoch aufgrund der fehlenden Z-Achse eine räumliche Beschreibung der Strukturen und eine Analyse von Fissions-/Fusionsprozessen nur bedingt zulässt.

In dieser Arbeit wurde an einem Mausmodell gezeigt, dass für die Erhebung physiopathologischer Veränderungen von Mitochondrien und die korrekte Beurteilung pathologischer Zustände die 3D-EM-Analysetechnik unerlässlich ist. Durch Entwicklung einer Analysestrategie konnten Ansätze definiert werden, die 2D-Ergebnisse mit den Daten aus 3D-Analysen in Beziehung setzen und morphometrische Parameter wie die Anzahl, die Formkomplexität, die Verteilung, die Belegung und die Größe von Mitochondrien miteinander vergleichen und korrelieren. Hier zeigten sich bei den Analyseverfahren deutliche Abweichungen in den mitochondrialen Morphologie-Parametern. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass eine 2D-Auswertung die Eigenschaften kardiomyozytärer Mitochondrien in Bezug auf die Anzahl, das Belegungsvolumen, die Größe, die Form sowie die Distribution von Mitochondrien nicht widerspiegelt und 2D-Aufnahmen zu Fehlinterpretationen führen können. Mit Hilfe der 3D-FIB-SEM-Methode konnte zudem gezeigt werden, dass eine genetische BNIP3-Deletion in C57BL/6J Mäusen zu mitochondrialen Agglomerationen mit höherer Volumenbelegung führt und eine Stauchung der Myofibrillenbündel induziert. Das Vorliegen einer erhöhten Anzahl von Mitochondrien, welche im Vergleich zu Wildtyp-Mitochondrien kleiner und weniger komplex sind, deutet auf eine physiologische Rolle von BNIP3 in der Fissions-/Fusions-Regulation.

Zur Identifizierung und Visualisierung der postulierten BNIP3- und BAX-abhängigen Porenbildung in der äußeren Mitochondrienmembran wurden molekular-biochemische Strukturanalysen mittels CLEM und Tokuyasu-Immunogoldmarkierung mit anschließenden TEM-Tomographien durchgeführt, die eine erste räumliche 3D-Beschreibung von BNIP3-/BAX-Immunogold-Markierungen an den Mitochondrien ermöglichten. Die eindeutige Identifikation der Pore und dessen Strukturanalyse bleibt bislang jedoch mit den EM-Methoden ungeklärt.

Des Weiteren wurde an I/R-Mausproben sowie an humanen Proben (Myokarditis- vs. Kontroll-Probe) gezeigt, dass die elektronenmikroskopische Analyse eine Beurteilung pathologischer Veränderungen zulässt. Da die EM sehr kleine Bereiche visualisiert und Herzgewebe eine heterogene Verteilung mitochondrialer Schäden aufweisen kann, ist die Auswahl der zu analysierenden Biopsiebereiche von großer Bedeutung. Zu diesem Zweck wurde das Mapping etabliert, das große Übersichtsaufnahmen ermöglicht und eine repräsentative Auswahl der zu analysierenden Bereiche erlaubt. Auch die Translation der 3D-Techniken auf humanes Herzgewebe durch schnellere und optimierte Arbeitsabläufe konnte gezeigt werden, was für die Routinediagnostik eine sinnvolle Ergänzung darstellt.

Cardiovascular diseases are one of the most common morbidity and mortality factors in our society and are associated with mitochondrial dysfunction and damage. The heart requires a lot of energy in the form of ATP produced by numerous mitochondria in the cardiomyocytes for its enormous pumping capacity. In addition to this key function, mitochondria also play an important role in cell death. In acute myocardial infarction, tissue damage is not solely based on ischemia, but also on reperfusion. In the so-called ischemia/reperfusion injury, mitochondria are damaged by pore formation in the outer and inner mitochondrial membrane (MOMP or mPTP) involving the BCL-2 proteins BNIP3 and BAX, determining the apoptotic and necrotic cell death of the cardiomyocytes. Alterations in mitochondrial morphology, including their size, volume, shape, number, distribution, and cristae structure, have also been observed and described in various cardiovascular diseases. Under physiological conditions, mitochondrial structural and functional integrity is maintained by fission/fusion processes and mitophagy. In this context, the involvement of BNIP3 is discussed. Studies of mitochondrial dynamics showed that influencing the fission/fusion process leads to massive mitochondrial accumulation in cardiomyocytes, accompanied by distortion of sarcomere structure. Precise and reproducible nanoscale image acquisition and analysis are essential for unambiguous qualitative and quantitative characterization of mitochondrial morphological alterations. Most studies routinely use 2D transmission electron microscopy, but the of a z-axis limits spatial description of structures and analysis of fission/fusion processes.

This thesis illustrated that for the evaluation of physiopathological alterations of mitochondria and the correct assessment of pathological conditions, the use of 3D electron microscopic analysis technique is essential. By developing analytical strategies and defining comparative approaches to relate 2D data to results from 3D analysis morphometric parameters such as number, size, shape, dispersion and distribution were correlated. The analysis methods showed significant variations in mitochondrial morphology parameters. The results demonstrated that 2D analysis does not reflect the characteristics of cardiomyocyte mitochondria in terms of number, size, shape, dispersion and distribution, and 2D images may lead to misinterpretation. Using the 3D FIB-SEM method, it was also shown that genetic BNIP3 deletion in C57BL/6J mice leads to mitochondrial agglomerations with higher volume occupancy and induces compression of myofibril bundles. The presence of increased numbers of mitochondria that are smaller and less complex compared with wildtype mitochondria suggests a physiological role for BNIP3 in the fission/fusion process.

To identify and visualize the postulated BNIP3- and BAX-dependent pore formation in the outer mitochondrial membrane, molecular biochemical structural analyses were performed using CLEM and Tokuyasu immunogold labeling followed by TEM tomography, which provided the first spatial 3D description of the mitochondrial localization of the BNIP3/BAX immunogold labeling. However, the unambiguous identification of the pore and its structural analysis remains unresolved to date using electron microscopic methods.

Furthermore, it was shown on I/R mouse samples as well as on human samples (myocarditis vs. control sample) that the electron microscopic analysis allows assessment of pathological changes. Because electron microscopy visualizes very small areas and cardiac tissue may show a heterogeneous distribution of mitochondrial damage, the selection of the biopsy areas to be analyzed is of great importance. For this purpose, mapping was established, which allows large overview images and allows a representative selection of areas to be analyzed. Also, the translation of 3D techniques to mitochondria of human cardiac tissue could be demonstrated by faster and optimized workflows, which is a useful tool for routine diagnostics.

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