Charakterisierung des Multi-Zinkfinger Transkriptionsfaktors Trps1 während der Chondrozyten Differenzierung
Trps1 ist ein Multi-Zinkfinger Transkriptionsfaktor, der regulatorische Funktionen während der Chondrozyten Proliferation und Differenzierung hat. Mutationen in der Trps1 Gensequenz resultieren in Defekten der Knochenentwicklung, wie Missbildungen des Gesichts, Kleinwuchs und einem frühzeitigen Verschluss der Wachstumsfuge. Wie Trps1 während der enchondralen Ossifikation regulatorische Funktionen ausübt, ist bisher nicht genau bekannt. Um die Funktion von Trps1 aufzuschlüsseln, wurden Co-Immunpräzipitations-Interaktionsstudien (Co-IP) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Trps1 endogen auf Proteinebene mit Hdac4, Hdac6 und Hsp90 interagiert.
Mittels Gelfiltrationsanalysen der Proteinkomplexe in Zelllysaten konnte gezeigt werden, dass Trps1 nicht als Monomer vorliegt, sondern nur in größeren Komplexen zwischen 307 und 687 kDa vorkommt und Überschneidungen mit Hdac1, Hdac4 und Hdac6 Proteinen hat, so dass vermutet werden kann, dass diese Proteine gemeinsam in Transkriptionskomplexen vorliegen können.
In einer massenspektrometrischen Analyse von Trps1 Co-IPs wurden neue potentielle Interaktoren des Trps1 Proteins identifiziert. Diese sind der Transkriptionsfaktor SUPT6H, das Nukleäre Körper Protein SP110, die RNA Helikase P110, sowie weitere Proteine der Hitze Schock Gruppe, wie Hsp70 und DnaJ.
Die Analyse der H3K9 und H3K18 Acetylierung und der Hdac Aktivität in Zellkulturen und Proteinextrakte aus Extremitäten verdeutlicht eine aktivierende Wirkung von Trps1 auf die Hdac Aktivität. Ein Verlust von Trps1 resultiert somit in hyperacetyliertem Chromatin. Diese Hyperacetylierung kann zu, in Trps1-/- Mäusen bekannten, itosedefekten führen.
Eine Hdac Inhibition, mittels TSA und NaB, während der Differenzierung der chondrogenen ATDC5 Zelllinie resultiert in einer stärkeren und beschleunigten Differenzierung. Eine Analyse der H3K9 Acetylierung während der Differenzierung zeigt jedoch einen Anstieg der Acetylierung nach sieben Tagen und anschließend einen Abfall der Acetylierung unabhängig von der Hdac Inhibition. Entweder wird für eine beschleunigte Differenzierung, durch Hdac Inhibition, nur ein Puls in der ersten Woche benötigt, oder die Inhibitoren wirken nicht auf die Histonedeacetylierung, sondern auf die Deacetylierung anderer Proteine wie z.B. Runx2, das ebenfalls von Hdacs deacetyliert werden kann. Somit könnte der Anstieg in der Acetylierung ein sekundärer Effekt sein, der durch die beschleunigte Differenzierung verursacht wird, die wiederum durch eine Deacetylierung anderer Proteine ausgelöst wurde
Trps1 is a multi-zinc finger transcription factor, regulating chondrocyte proliferation and differentiation. Mutations in the Trps1 gene sequence results in defects of bone formation, like malformations of the facial bones, dwarfism and a premature closure of the growth plate. But how Trps1 is regulating the endochondral ossification is not exactly known so far. To elucidate the details of Trps1 function, Co-Immunoprecipitation (Co-IP) interaction studies were performed. In this study could be shown, that endogenous Trps1 interacts on protein level with endogenous Hdac4, Hdac6 and Hsp90. Gelfiltration experiments with protein complexes of cell lysates show that Trps1 elutes not as a monomer but in higher order complexes between 307 and 687 kDa. Hdac1, Hdac4 and Hdac6 elute partly in the same fractions, so that it can be assumed that these proteins could act together in the same transcription complexes.
The analysis of H3K9 and H3K18 acetylation and Hdac activity in cell cultures and mouse limb extracts points up an activating Trps1 action on Hdac activity. Trps1 deficiency results in hyperacetylated chromatin. This could lead to defects in mitosis, which are common in Trps1-/- mice.
In a mass spectrometric analysis of Trps1 Co-IPs new potential Trps1 interacting proteins could be identified. These are the transcription factor SUPT6H, the Nuclear Body Protein SP110, the RNA Helicase P110, as well as proteins of the heat shock group like Hsp70 and DnaJ.
Hdac inhibition, due to TSA and NaB treatment, during differentiation of chondrogenic ATDC5 cells results in a stronger and faster differentiation. But the analysis of the H3K9 acetylation during the differentiation process showed, despite Hdac inhibition, the acetylation is enhanced in the first week, only. From the second week on the acetylation is steadily reduced. Either the Hdac inhibition pulse is only needed in the first week for an accelerated differentiation, or the inhibitors act by deacetylating other proteins like Runx2, which can be deacetylated by Hdacs. So the enhanced acetylation in the first week could be a secondary effect due to an enhanced differentiation, which resulted from deacetylation of other proteins.
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