Prostatakrebs stellt in Deutschland und in Europa mit ca. 60000 Neuerkrankungen im Jahr die häufigste Krebserkrankung bei Männern dar[3,4] und ist für ca. 10 % aller krebsassoziierten Todesfälle verantwortlich.[3,5] Für eine erfolgreiche Tumorbehandlung ist eine gesicherte Diagnose im sehr frühen Anfangsstadium der Krebsentwicklung erforderlich. Zu Beginn der Krebsentwicklung kann der Tumor noch ohne ein eigenes Versorgungssystem wachsen. Sobald er aber eine bestimmte Größe überschreitet muss er zum weiteren Wachstum ein eigenes Gefäßbett initiieren. Deshalb ist der Nachweis einer Neubildung von Blutgefäßen (Neoangiogenese) seit einiger Zeit im Fokus der Krebs-Diagnoseentwicklung. Diese Diagnostik sollte nicht-invasiv, kostengünstig und schnell durchführbar sein. Diese Voraussetzungen werden zurzeit nur von der Ultraschalldiagnostik erfüllt. Im Falle der Prostata-Diagnose werden Mikropartikel zur Kontrastverstärkung eingesetzt. Deren Verwendung, als molekulare Markersysteme zur zuverlässigen Darstellung des mikrovaskulären Tumorgefäßbetts, ist jedoch bisher nicht über tierbasierte in vivo Studien hinausgegangen, wie die aktuelle „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ des National Center for Biotechnology Information (US) zeigt.[153] Unsere Arbeitsgruppe identifizierte in vorangegangenen Studien CEACAM1 als Neoangiogenesemarker in Endothelzellen in neugebildeten Tumorblutgefäßen.[41] Eine spezifische Markierung dieses Proteins mit ultraschallgeeigneten Partikeln stellt ein neues molekulares Markersystem zur Visualisierung des Tumorgefäßbetts im Tumor-Frühstadium mittels Ultraschall dar. Daher wurde zunächst das kommerziell erhältliche Ultraschallkontrastmittel SonoVue [SV] der Firma Bracco mit einem in unserer Arbeitsgruppe entwickelten CEACAM1-spezifischen Antikörper beladen, um ein solches Markersystem zu generieren. Allerdings stellten sich dabei die [SV] Partikel, aufgrund ihrer geringen Stabilität und des Fehlens einer kovalenten Bindungsmöglichkeit für Antikörper, als gänzlich ungeeignet heraus. Die Bindung erfolgte hier lediglich über Adsorption. Eine solch gering affine Bindung ist aber für Anwendungen in der Angiologie, wo starke Scherkräfte auftreten, nicht ausreichend. Aus diesem Grund wurden weitere kommerziell erhältliche Partikel mit dem CEACAM1-spezifischen Antikörper beladen und analysiert. Eine Bindung an Protein G Partikel sollte hierbei die korrekte Ausrichtung der Antikörper sicherstellen. Die Bindung über das Biotin-Streptavidin System mit weiteren Partikeln gewährleistete dagegen die Flexibilität der Antikörper. Beide Systeme ermöglichten zudem kovalent ähnlichen Bindungscharakter. Für die Untersuchung der Bindungseigenschaften dieser CEACAM1-bindenden Partikel sollte als in vitro Testsystem die Endothelzelllinie eines Angiosarkoms der Kopfhaut (AS-M.5) eingesetzt werden, da diese unter anderem CEACAM1+ sind. Bei deren Verwendung bestand jedoch keine Möglichkeit, den Grad der unspezifischen Bindung CEACAM1-bindender Partikel zu analysieren. Daher wurde zunächst in einem in vitro Testsystem mit einer humanen CEACAM1 stabil transfizierten HeLa Zelllinie gearbeitet. Als Kontrolle und zum Nachweis unspezifischer Bindung stand somit die HeLa Wildtyp Zelllinie zur Verfügung. In unserer Arbeitsgruppe stand zusätzlich eine HeLa Zelllinie mit stabil transfizierten CEACAM8 zur Verfügung, welches normalerweise ausschließlich auf Granulocyten expremiert wird. Des Weiteren wird CEACAM8 nicht nur an Zell-Zell Kontaktstellen, sondern auch vermehrt apikal expremiert[85,86]. Zusätzlich ist es über eine GPI-Verankerung und nicht wie CEACAM1 transmembran an der Zellmembran gebunden, wodurch CEACAM8 eine höhere laterale Beweglichkeit in der Zellmembran besitzt[87]. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten jedoch, dass weder die Art der Membranverankerung noch die Lokalisation der Proteine einen Einfluss auf die Bindung antikörperbeladener Partikel hatte. Diese Zelllinie wurde daher ebenfalls zur parallelen Entwicklung einer Isotypenkontrolle zu den CEACAM1-bindenden Partikeln genutzt. Neben den [SV] Partikeln erwiesen sich auch die eingesetzten Roti-MagBeads Protein G [RPGB] Partikel der Firma Carl Roth aufgrund ihrer unspezifischen Bindung für die geplanten Anwendungen als nicht geeignet. Diese war so stark ausgeprägt, dass die Ergebnisse der Kontrollen nahezu identisch zu den Versuchsergebnissen waren. Die Targestar [TS] Partikel der Firma Targeson, die Dynabeads® M-280 Streptavidin [SDB] der Firma Invitrogen und die Protein G MicroBeads [MPGB] der Firma Miltenyi ergaben hingegen vielversprechende positive Resultate. So zeigten diese drei Partikelarten eine eindeutige antikörpervermittelte Bindung und lediglich bei den [SDB] Partikeln einen vernachlässigbaren unspezifischen Bindungsanteil. Allerdings können [MPGB] Partikel für ultraschallbasierte Diagnostik nicht verwendet werden, da Nanopartikel im Ultraschall nicht detektierbar sind.[89] Sie könnten jedoch bei Fragestellungen im Bereich von MRT-Untersuchungen eingesetzt werden. Für weiterführende Untersuchungen im in vitro Testsystem mit AS-M.5 Zellen sollten daher die vielversprechenden [TS] Partikel, welche speziell für in vivo Ultraschalluntersuchungen entwickelt wurden, und die [SDB] Partikel verwendet werden. Hierbei würden sich die [SDB] Partikel als Kontrollmarkersystem bei in vitro Untersuchungen anbieten. Trotz der eindeutigen Ergebnisse müssten die Partikel zur weiteren Verwendung modifiziert werden, da sie aufgrund ihrer Größe von Makrophagen erkannt und durch das Retikuloendotheliale System (RES) entfernt werden könnten.[134] Eine Maskierung zum Beispiel durch das Verwenden von Polyethylenglycolen würde dies verhindern.[125,135,136] Des Weiteren würden das Kopplungsprotein Streptavidin und das Fc-Fragment des gebundenen Antikörpers in humanen Anwendungen Immunogenität hervorrufen.[126,144] Diese Immunogenität aufgrund des Fc-Fragments könnte durch die Verwendung der F(ab)2-Fragmente umgangen werden, wobei die Beladung der Partikel über bivalente Crosslinker erfolgen müsste. Dadurch würde eine kovalente ortsspezifische Bindung erreicht und gleichzeitig der Einsatz eines Kopplungsproteins vermieden werden. Der Einsatz von Polyethylenglycolen mit entsprechenden reaktiven Endgruppen als Crosslinker würde zudem die Flexibilität und damit die Antigenerkennung aufrecht halten.[125] Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit den ersten Schritt bei der Etablierung CEACAM1 bindender Partikel für die bildgebende Diagnostik des Prostatakarzinoms darstellen. Dieses System würde sich sehr gut in die molekularen Markersysteme der „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ einfügen.[153]