Open Access

Christiane Dörte Much

• Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind Fehlbildungen im neurovaskulären System, welche aufgrund von Krampfanfällen und hämorrhagischen Schlaganfällen zu einer stark eingeschränkten Lebensqualität führen können. Die Prävalenz von symptomatischen, autosomal-dominant erblichen CCMs auf Basis einer pathogenen Keimbahnvariante in einem der drei Gene CCM1, CCM2 oder CCM3 wird auf 1:5400 bis 1:6200 geschätzt. Durch Genpanelanalysen können sowohl Punktmutationen als auch kleine Indels und Kopienzahlveränderungen in einem parallelen Ansatz nachgewiesen werden. Zur weiteren Aufklärung der molekularen Pathogenese hereditärer Kavernome und zur Suche nach potenziellen Therapieansätzen wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein Patienten-spezifisches in vitro Zellmodell der Kavernomatose etabliert. Hierzu wurden zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (Blood Outgrowth Endothelial Cells, BOECs) aus dem Blut eines CCM-Patienten mit krankheitsverursachender heterozygoter CCM1-Keimbahnveränderung isoliert. Im Sinne der Knudson´schen Zweischrittinaktivierung zur Entstehung von Kavernomen wurde das zweite CCM1-Allel in Zellkulturen mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie ausgeschaltet. In klonal expandierten Zellkolonien konnte das Vorliegen einer Compound-Heterozygotie für die CCM1-Keimbahnvariante und eine zweite CRISPR/Cas9-induzierte loss-of-function Variante bestätigt werden. Durch die zweite Mutation zeigten sich morphologische Veränderungen, die Störung endothelialer Zell-Zell-Verbindungen und eine vermehrte Aktin-Stressfaserbildung sowie eine deutliche Hochregulation des Transkriptionsfaktors KLF2. Zudem führte die komplette Inaktivierung des CCM1-Gens zu einer Akkumulation des von-Willebrand-Faktors (vWF). Die in der vorgelegten Arbeit erstmals beschriebene starke Anreicherung des vWF konnte in immortalisierten humanen Endothelzellen und zudem im Kavernomgewebe von Trägern pathogener CCM1-, CCM2- oder CCM3-Veränderungen bestätigt werden. Es ist daher denkbar, dass der erhöhte vWF-Spiegel im Endothel des kavernösen Gefäßkonvoluts zum lokalen hämostatischen Ungleichgewicht beiträgt. Im Patienten-spezifischen BOEC-Modell konnte zudem erstmals in einem nicht-viralen und Plasmid-freien Ribonukleoprotein-basierten CRISPR/Cas9-Ansatz eine Mutationskorrektur der vorliegenden CCM1-Keimbahnveränderung erreicht werden. Die Ergebnisse der weiteren Kultivierungen und Amplikon-Tiefensequenzierungen zeigten jedoch sehr eindrücklich, dass der klonogene Überlebensvorteil von verbleibenden CCM1-inaktivierten BOECs zu einem deutlichen Überwachsen der korrigierten BOECs im Zellgemisch führt und eine CRISPR/Cas9-vermittelte Mutationskorrektur damit für CCM-Patient*innen keine realistische Therapieoption darstellt. Diese Ergebnisse fließen in neue Ansätze der Therapieentwicklung ein, welche vor allem den klonalen Überlebensvorteil und die Apoptoseresistenz CCM-defizienter Zellen adressieren.
• Cerebral cavernous malformations (CCMs) are vascular lesions that can lead to a severely impaired quality of life due to seizures and hemorrhagic strokes. The prevalence of symptomatic autosomal-dominant inherited CCMs based on a pathogenic germline variant in one of the three genes CCM1, CCM2 or CCM3 is estimated to be 1:5400 to 1:6200. In a single approach gene panel analyses can detect point mutations as well as small indels and copy number variations. To further elucidate the molecular pathogenesis of hereditary CCMs and to search for potential therapeutic approaches, a patient-specific in vitro cell model of CCM disease was established for the first time in this work. For this purpose, circulating endothelial progenitor cells (Blood Outgrowth Endothelial Cells, BOECs) were isolated from the blood of a CCM patient with a disease-causing heterozygous CCM1 germline variant. Using CRISPR/Cas9 technology the second CCM1 allele was knocked out in cell cultures in line with Knudson's two-step inactivation for the development of cavernous malformations. In clonally expanded cell colonies, the presence of compound heterozygosity for the CCM1 germline variant and a second CRISPR/Cas9-induced loss-of-function variant could be confirmed. The second mutation resulted in morphological changes, disruption of endothelial cell-cell junctions and an increased actin stress fiber formation, as well as a marked upregulation of the transcription factor KLF2. In addition, the complete inactivation of the CCM1 gene led to an accumulation of von Willebrand factor (vWF). The strong increase of vWF described for the first time in this work could be confirmed in immortalized human endothelial cells and also in the CCM tissue samples of carriers of pathogenic CCM1, CCM2 or CCM3 variants. It is therefore conceivable that the increased vWF level in the endothelium of the cavernous vasculature contributes to the local hemostatic imbalance. Furthermore, in the patient-specific BOEC model a precise correction of the present CCM1 germline variant could be achieved for the first time in a non-viral and plasmid-free ribonucleoprotein-based CRISPR/Cas9 approach. However, the results of further cultivations and amplicon deep sequencing showed very impressively that the clonogenic survival advantage of remaining CCM1-inactivated BOECs leads to a clear overgrowth of the corrected BOECs in the cell mixture and that a CRISPR/Cas9-mediated mutation correction is no realistic treatment option for CCM patients. These results are included into new approaches to therapy development which primarily address the clonal survival advantage and the apoptosis resistance of CCM-deficient cells.