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Madlin Potratz

• Bisherige Analysen von RABV-Pathogenitätsdeterminanten wurden mit laboradaptierten, teils attenuierten Viren durchgeführt. Es ist unklar, ob bisher untersuchte Faktoren auch für hoch virulente RABV-Feldviren relevant sind. Der hier durchgeführte systematische Vergleich von Feldviren und Laborstämmen im infizierten Tier konnte Unterschiede hinsichtlich der Fähigkeit immunkompetente Neuroglia des ZNS zu infizieren als mögliche Pathogenitätsdeterminante aufzeigen. Darüber hinaus wurden erstmals SZ-Neuroglia peripherer Nerven als Zielzellen für die RABV-Infektion identifiziert. Für die Analyse von RABV-infizierten Geweben wurde ein modernes 3D Imaging-Verfahren angewandt. Gehirne aus experimentell infizierten Mäusen und Frettchen wurden wie in Veröffentlichung 1 beschrieben immunfluoreszenz-gefärbt, optisch geklärt und hochauflösend mit einem konfokalen Laserscan Mikroskop untersucht. RABV N und P Protein konnten dreidimensional in räumlicher Umgebung zu zellulären Strukturen des Wirtes visualisiert werden. Diese Untersuchung bewies die besondere Eignung des Verfahrens zur Identifizierung vereinzelter Zielstrukturen und wurde für nachfolgende systematische Analysen im ZNS und PNS verwendet. Der RABV-Zelltropismus wurde als vermutlich wichtige Pathogenitätsdeterminante in Veröffentlichung 2 untersucht. RABV Feldviren vom Hund (rRABV Dog), Fuchs (rRABV Fox) und Waschbär (rRABV Rac) konnten im Vergleich zu den laboradaptierten Viren (rCVS-11, SAD L16 und ERA) nicht-neuronale Zellen im ZNS wie Astroglia produktiv infizieren. Der Anteil infizierter Astrozyten ist mit 7-17 % nach i.m. Inokulation vergleichbar mit dem der Neuronen (7-19 %). Interessanterweise wurde eine Inokulationsroutenabhängige Infektion von Astrozyten mit dem moderat virulenten Laborstamm rCVS-11 beobachtet. Diese systematische und quantitative Analyse des RABV-Astrozyten- und Neuronentropismus zeigt, dass mit abnehmender Virulenz die Fähigkeit der Viren produktiv in Astroglia im ZNS zu replizieren abnimmt. Die Fähigkeit eine produktive Infektion in Astrozyten auszubilden, scheint demnach ein grundlegender Unterschied zwischen Feldviren und weniger virulenten Laborstämmen zu sein. Weiterführend wurde in Veröffentlichung 3 die Virusausbreitung vom ZNS in periphere Nerven untersucht. Hinterbeine, Wirbelsäule inklusive Rückenmark, Gehirn und weitere Kopfbereiche experimentell infizierter Mäuse wurden mittels Lichtblatt- und konfokaler Laserscanmikroskopie analysiert. Zum Ersten Mal konnte eine RABV-Infektion peripherer Neuroglia dargestellt werden. Eine produktive Infektion immunkompetenter SZ im PNS ist also möglicherweise, genauso wie die Infektion von Astrozyten im ZNS, entscheidend für die RABV-Neuropathogenese. Die Detektion von RABV-Antigen im Hinterbein nach i.c. Inokulation beweist eine anterograde axonale Virusausbreitung vom ZNS in periphere Nerven. Interessanterweise konnte das Virus auch in Bereichen des Nasopharynx und des Zungenepithels nachgewiesen werden, worüber möglicherweise zusätzlich zur Speicheldrüse Virus in den Nasenrachenraum ausgeschieden wird. Zusammenfassend konnten mit dieser Arbeit neue Einblicke hinsichtlich des Zelltropismus und der Ausbreitung von RABV in vivo im Modellorganismus Maus gewonnen werden. Die Fähigkeit der untersuchten hoch virulenten Feldviren nicht-neuronale, immunkompetente Neuroglia des ZNS und PNS zu infizieren unterscheidet diese von den weniger virulenten bzw. apathogenen Virusstämmen und könnte ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer Tollwut-Enzephalitis darstellen.
• Previous studies of rabies virus (RABV) pathogenicity determinants were implemented with lab adapted or attenuated viruses. It is unclear, if so far analyzed factors are also relevant for highly virulent RABV field viruses. Here, a systemic comparison in vivo of fixed and field viruses, revealed the ability to infect immunocompetent neuroglia in the central nervous system (CNS) as a possible pathogenicity determinant. Furthermore, for the first time Schwann cell (SC) neuroglia of peripheral nerves were identified as target cells for RABV infection. A modern 3D imaging technique was used to analyze RABV infected tissues. Brains from experimental infected mice and ferrets were stained by immunofluorescence, followed by optical clearing, as described in publication 1, and analyzed with a high-resolution confocal laser scan microscope. RABV N and P protein were visualized three-dimensional in spatial proximity to hosts cellular structures. The results demonstrated the specific suitability of this technique to identify single target structures, wherefore the technique was used for following analysis in CNS and peripheral nervous system (PNS). RABV cell tropism was investigated as presumably pathogenicity determinant in publication 2. Field RABV from dog (rRABV dog), fox (rRABV fox) and raccoon (rRABV rac) were able to infect non-neuronal cells, like astrocytes, in the CNS in contrast to lab adapted viruses (rCVS-11, SAD L16 and ERA). The amount of infected astrocytes after intra muscular (i.m.) inoculation is with 7-17 % infected astrocytes comparable to 7-19 % infected neurons. Interestingly, inoculation-route dependent infection of astrocytes with moderate virulent rCVS-11 was observed. This systemic and quantitative analysis of RABV astrocyte and neuron tropism showed, that with decreasing virulence also the ability to infect astrocytes decreases. Therefore, the ability to infect astrocytes might be a fundamental difference between field and less virulent lab strains. In publication 3 the virus spread from the CNS to peripheral nerves was investigated. Hind legs, spinal column with spinal cord, brain and heads from experimental infected mice were analyzed with light sheet and confocal laser scan microscopy. For the first time a RABV infection of peripheral neuroglia was visualized. A productive infection of immunocompetent SZ in the PNS might be, equally like the infection of astrocytes in the CNS, crucial for RABV neuropathogenesis. The detection of RABV antigen in hind legs after intra cranial (i.c.) inoculation proves an anterograde axonal virus spread from CNS in peripheral nerves. Interestingly, the virus was also detected in areas of nasopharynx and tongue epithelia, which might be an additional site of virus shedding beside the salivary glands. In summary, with this work new insights regarding cell tropism and spreading of RABV in vivo in model organism mouse were obtained. The ability of the investigated highly virulent field viruses to infect non-neuronal, immunocompetent neuroglia of CNS and PNS is a main difference to less virulent or apathogen virus strains and might be a crucial determinant of rabies encephalitis.