Zellfreie Synthese von schwer herstellbaren Proteinen

Bock, Sinja

VolltextDissertation2014Public AccessUrhG

Zellfreie Synthese von schwer herstellbaren Proteinen

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Die zellfreie Proteinsynthese ermöglicht es auf eine alternative Weise in vitro Proteine herzustellen, die in den traditionellen in vivo Expressionssystemen, wie E. coli, Hefe oder Xenopus Oozyten eher schwierig zu produzieren sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daraufhin eine Faltungskontrolle entwickelt, bei der mithilfe der Fluoreszenz eines C-Terminal fusionierten GFP (grün fluoreszierendes Protein) auf die richtige Faltung des Proteins geschlossen werden kann. Hierzu wurden verschiedene Membranproteine unterschiedlichen Ursprungs in einem E. coli basierten, zellfreien System mit dem Zusatz von Detergenzien hergestellt und teilweise funktionell getestet. So konnte der Influenza A M2 Protonenkanal zellfrei hergestellt, in Liposomen rekonstituiert und anschließend elektrophysiologisch getestet werden. Ebenso ließ sich das humane intrazelluläre Membranprotein Aquaporin 11 (AQP11) zellfrei und in der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum herstellen, was zuvor nicht in E. coli, Hefe oder Xenopus Oozyten gelang. Zusätzlich konnte in beiden Systemen mittels Stopped Flow Messungen eine sieben- bis achtfach höhere Wasserleitfähigkeit als in den Negativkontrollen ohne AQP11 gezeigt werden. Das Membranprotein PfFNT, ein Formiat-Nitrit Transporter aus dem parasitären Malariaerreger Plasmodium falciparum konnte ebenfalls zellfrei hergestellt werden. Allerdings war es hier nötig die sehr Adenin+Thymin (A+T) reiche DNA-Sequenz dem A+T Gehalt und der Codonhäufigkeit des E. coli Genoms anzupassen. Dann war es möglich das PfFNT in größeren Mengen herzustellen, so dass erste Kristallisationsversuche durchgeführt werden konnten. Diese führten aber vorerst zu keinem Erfolg. Des Weiteren konnte das lösliche Protein Amoebapore A aus dem Parasiten Entamoeba histolytica zellfrei hergestellt werden. Hier war es zuvor nicht möglich das Protein aufgrund seiner Toxizität heterolog in E. coli Zellen zu exprimieren. Mit der zellfreien Proteinherstellung lassen sich also auch schwierige Proteine schnell herstellen. Es lassen sich innerhalb von zwei Tagen aus 1 ml Ansatz um die 2,3 mg Protein herstellen und soweit reinigen, dass sie für die Funktionstestung verwendet werden können.

The cell-free expression system allows to produce in vitro protein in an alternative manner, instead of using traditional in vivo expression systems, such as E. coli, yeast or Xenopus oocytes for difficult-to-express proteins. In this work, a folding control was generated to indicate the proper folding of a protein by fluorescence with a C- terminally fused GFP (green fluorescent protein). Different membrane proteins from various origin were therefore expressed with detergents in a E. coli based, cell-free system and in part functional tested. This way, the Influenza A M2 proton channel could be cell-free expressed, reconstituted into liposomes and then tested electrophysically. Furthermore, the intracellular human membrane protein Aquaporin 11 (AQP11) could also be expressed in the cell-free system as well as in the social amoeba Dictyostelium discoideum. Previously it was not possible to produce this protein in E. coli, yeast or Xenopus oocytes. Additionally, measurements with the stopped flow apparatus showed seven to eight times higher water conductance of AQP11 than the negative control without AQP11 in both systems. The membrane protein PfFNT, a formate-nitrit transporter from the malaria parasite Plasmodium falciparum was also cell-free expressed. In this case it was necessary to adapt the DNA sequence with very high adenine+thymine (A+T) content to the A+T content and codon usage of a E. coli genome. Thereafter, it was possible to produce PfFNT in sufficient amounts to try crystallization, which was not successful for now. Another cell-free expressed protein was the soluble protein Amoebapore A from the parasite Entamoeba histolytica. Before, it was impossible to express it heterologously in E. coli cells due to its cell toxicity. In summary, the cell-free protein expression allows to rapidly produce difficult-to-express proteins. Within two days 2.3mg protein from 1ml reaction mix can be generated in as pure quality as it is needed for functional testing.