Axonal injuries to motoneurons of adult mammals cause, among other responses, loss of synaptic terminals from their cell bodies and dendrites. This “synaptic stripping” is largely, but not always completely reversed after successful axonal regeneration and muscle reinnervation. Long-lasting deficits in, e.g., cholinergic and glutamatergic afferent terminals, correlate negatively with degree of functional recovery in rats suggesting that persistent partial deafferentation of motoneurons may be a factor limiting functional recovery after peripheral nerve injury. AimsTo further explore the idea that functional recovery is partially linked to restoration of synaptic inputs to regenerated motoneurons, we pursued to modulate the deafferentation of motoneurons following nerve section/suture and monitor the effects of this manipulation on the outcome of peripheral nerve regeneration. Two neuroactive molecules, botulinum neurotoxin A (BoNT) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), known for their ability to influence synaptic inputs to neurons, were selected as manipulation tools. Drug solutions were applied to the proximal stump of the freshly cut femoral nerve of rats to achieve drug uptake and transport to the neuronal perikarya and possibly transcytosis to afferent synapses. The experiments were performed in adult (10-week-old) female Wistar rats which received either BoNT (N = 17), BDNF (N = 15) or bovine serum albumin treatment (BSA, control, N = 13). After drug application, the femoral nerve was surgically reconstructed and functional recovery was monitored over a 5-month period using an established gait analysis protocol. Other outcome measures were quality of endplate reinnervation (occurrence of abnormal polyinnervation assessed morphologically) and numbers of cholinergic, GABA/glycinergic and glutamatergic synaptic terminals in the femoral motor nucleus in the spinal cord (assessed using stereological approaches). Application of BoNT, but not BDNF, resulted in a marked, as compared with BSA, improvement of motor recovery at 2 to 20 weeks after injury. At two months, BoNT-treated rats had an attenuated loss of perisomatic cholinergic terminals compared with the other two treatments. Analysis of individual animal data revealed significant linear correlations between functional parameters and numbers of cholinergic terminals. Quality of endplate reinnervation was not affected by treatment with BoNT or BDNF. The effect of BoNT on synaptic terminals is possibly related to transcytosis of BoNT into perisomatic nerve terminals as suggested by immunohistochemical analysis of cleaved SNAP-25. In turn, better preservation of modulatory cholinergic terminals, which are crucial for normal motoneuron excitability, might underlie enhanced recovery of function in BoNT-treated rats. The findings support the idea that persistent partial deafferentation of axotomized motoneurons is a factor contributing to deficient functional recovery after nerve injury. Intraneural application of drugs appears to be a promising way to analyze causal relationships between synaptic plasticity and restoration of function. In addition, it is thinkable that the described drug application approach may evolve into a clinically feasible therapy if further controlled animal experiments provide convincing evidence for its safety and efficacy.
Läsionen peripherer Nerven von erwachsenen Säugetieren verursachen Verlust von Synapsen an Zellkörpern und Dendriten von Motoneuronen. Diese Deafferenzierung (“synaptic stripping“) ist, selbst nach erfolgreicher Nervenregeneration und Reinnervation der Muskulatur, nicht immer vollkommen reversibel. Langfristige Defizite sind für cholinerge und glutamaterge Afferenzen nachgewiesen und diese korrelieren negativ mit dem Grad der funktionellen Erholung bei Ratten. Es kann angenommen werden, dass eine persistierende partielle Deafferenzierung von Motoneuronen das funktionelle Outcome einer peripheren Nervenverletzung beeinträchtigen kann. Um die o. g. Hypothese zu überprüfen, wurde hier versucht die Deafferenzierung der Motoneurone nach Durchtrennung und Naht des Nervus femoralis der Ratte zu manipulieren. Zwei neuroaktive Moleküle, Botulinum-Neurotoxin A (BoNT) und Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), die bekanntlich synaptische Eingänge an Neuronen beeinflussen, wurden als „Manipulationswerkzeuge“ ausgewählt. Die Effekte dieser Behandlungen auf das Outcome der Nervenregeneration wurden funktionell und strukturell untersucht. BoNT oder BDNF wurden an den proximalen Stumpf des durchtrennten Nervus femoralis appliziert, um ihre Aufnahme und den Transport zu den Perikarya sowie eventuell die Transzytose zu afferenten Synapsen zu erreichen. Als Kontrolle diente bovines Serumalbumin (BSA). Die Experimente wurden an erwachsenen, zehn Wochen alten weiblichen Wistar Ratten durchgeführt, die entweder eine BoNT (N = 17), BDNF (N = 15) oder BSA (N = 13) Behandlung erhielten. Nach der Applikation wurde der Nerv chirurgisch rekonstruiert und die funktionelle Erholung mithilfe eines etablierten Ganganalyseverfahrens in einem Zeitraum von fünf Monaten dokumentiert. Weitere Outcome-Parameter waren die Qualität der Endplattenreinnervation (Auftreten anormaler Polyinnervation) und die Anzahl der 8 cholinergen, GABA/glycinergen und glutamatergen synaptischen Terminale im motorischen Kern des N. femoralis im Rückenmark. Zwei bis 20 Wochen nach der Läsion war die funktionelle Erholung nach BoNT Applikation signifikant besser im Vergleich zu den anderen beiden Behandlungen. Der posttraumatische Verlust an perisomatischen cholinergen Synapsen zwei Monate nach der Operation war ebenso reduziert in BoNT-behandelten Tieren. Regressionsanalysen zeigten signifikante lineare Korrelationen zwischen Funktionsparametern und der Anzahl cholinerger Terminale. Die Qualität der Endplattenreinnervation wurde nicht durch die Behandlung mit BoNT oder BDNF beeinflusst. Die Effekte von BoNT beruhen, wie durch Nachweis von gespaltetem SNAP-25 in perisomatischen Nerventerminale angedeutet, möglicherweise auf BoNT Transzytose. Eine bessere Erhaltung der modulatorischen cholinergen Terminale, die für die normale Erregbarkeit von Motoneuronen von entscheidender Bedeutung sind, könnte wiederum einer verbesserten Erholung der Funktion bei mit BoNT behandelten Ratten zugrunde liegen Die Ergebnisse stützen die Hypothese, dass langanhaltende partielle Deafferenzierungen von Motoneuronen negative Auswirkungen auf die funktionelle Erholung nach Nervenläsionen haben können. Die intraneurale Anwendung von neuroaktiven Substanzen scheint ein vielversprechender Weg zu sein, um kausale Zusammenhänge zwischen synaptischer Plastizität und Wiederherstellung der Funktion zu analysieren. Es ist außerdem denkbar, dass sich der beschriebene Ansatz der Arzneimittelapplikation zu einer klinisch durchführbaren Therapie entwickeln kann, wenn weitere kontrollierte Tierversuche überzeugende Beweise für seine Sicherheit und Wirksamkeit liefern.
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