Identifizierung und Charakterisierung von Komponenten im transkriptionsaktiven Chromosom (TAC)

Die Transkription plastidärer Gene wird von zwei verschiedenen DNA-abhängigen RNA-Polymerasen übernommen: einer plastidenkodierten (PEP, plastid encoded polymerase) und einer kernkodierten RNA-Polymerase (NEP, nuclear encoded polymerase), die sich sowohl strukturell als auch funktionell unterscheiden (Hess und Börner, 1999). Die plastidenkodierte RNA-Polymerase konnte nach biochemischer Fraktionierung von Chloroplastenproteinen in zwei unterschiedlichen Fraktionen, dem TAC (transcriptionallyactive chromosome), einem hochmolekularen DNA/RNA-Protein-Komplex, sowie der sRNAP (soluble RNA polymerase), immunologisch nachgewiesen werden (Suck et al., 1996; Krause und Krupinska, 2000). Ziel der hier vorgelegten Arbeit war die Identifizierung von neuen Faktoren, die an der plastidären Genexpression beteiligt sind. Hierfür bietet sich die massenspektrometrische Analyse des transkriptionsaktiven DNA/RNA-Protein-Komplexes (TAC) an. Darüber hinaus sollten durch Untersuchungen von knock-out Mutanten essentielle Komponenten des TAC charakterisiert werden, die an transkriptionellen oder posttranskriptionellen Prozessen beteiligt sind. Dies erfolgte über die Sichtung einer Mutantenpopulation, bestehend aus Linien mit T-DNA-Insertionen in Genen, die für die im TAC identifizierten Proteine kodieren. Mittels ESI-IONTRAP (electrospray ionization – ion trap) konnten insgesamt 26 Proteine in durch Gelfiltrationschromatographie angereicherten TAC-Fraktionen aus Arabidopsis thaliana und Sinapis alba identifiziert werden. Davon sind 14 Proteine, einschließlich der vier Untereinheiten des core-Enzyms der plastidären RNA-Polymerase, an Prozessen wie Replikation, Transkription, Translation, Detoxifikation, Proteinmodifikation sowie Metabolismus beteiligt bzw. auf Grund hoher Sequenzübereinstimmungen zu bereits untersuchten Proteinen den genannten Funktionsklassen zuzuordnen. Darüber hinaus konnten zwölf Proteine (Bez.: PTAC) unbekannter Funktion identifiziert werden. Computerbasierenden Analysen zu Folge handelt es sich bei fünf dieser Proteine um DNA/RNA-Binde-Proteine. Die biochemische Aufreinigung von DNA/RNA-Binde-Proteinen aus einer angereicherten TAC-Fraktion mittels Heparin-Sepharose-Chromatographie führte zur Isolation von neun der 26 identifizierten TAC-Proteine. Ein Vergleich der identifizierten Proteine aus Arabidopsis thaliana und Sinapis alba lässt auf eine entwicklungsbedingte Proteinzusammensetzung des TAC-Komplexes schließen.