Angesichts der zunehmenden Zahl bakterieller Resistenzen gegen Antibiotika ist es erforderlich, neue antimikrobielle Verfahren mit dem Ziel zu etablieren, die Anwendung systemischer wie auch lokaler Antibiotika so weit wie möglich ersetzen zu können. Eine vielversprechende Alternative hierbei stellt die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) dar. Ziel dieser Arbeit war es, den ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Angesichts der zunehmenden Zahl bakterieller Resistenzen gegen Antibiotika ist es erforderlich, neue antimikrobielle Verfahren mit dem Ziel zu etablieren, die Anwendung systemischer wie auch lokaler Antibiotika so weit wie möglich ersetzen zu können. Eine vielversprechende Alternative hierbei stellt die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) dar. Ziel dieser Arbeit war es, den Wirkmechanismus und die Zielstrukturen der aPDT mit SAPYR als Photosensibilisator zu untersuchen. Dazu wurden zunächst Monospezies-Biofilme von Actinomyces naeslundii und Streptococcus mutans sowie Escherichia coli kultiviert, mit aPDT und SAPYR in verschiedenen Konzentrationen und unterschiedlichen Inkubationszeiten behandelt und anschließend bestrahlt. Die Replikationsfähigkeit der Bakterien nach aPDT wurde mit Hilfe eines KBE-Assays ermittelt. Die Integrität der Zytoplasmamembran wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von SYBR Green und Propidiumiodid gemessen und mit Hilfe der Raster- und
Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert. Weiterhin wurden mit Lumineszenz und Fluoreszenzmessungen die Stoffwechselaktivität sowie die Bildung und intrazellulärer ROS untersucht. Im weiteren Verlauf wurden Änderungen auf Protein- und Transkriptomebene mit Hilfe von Western Blot und RNA-Sequenzierung bei planktonisch wachsenden E. coli- und S. mutans-Kulturen nach aPDT und Behandlung mit CHX untersucht. Des Weiteren erfolgte eine Untersuchung der Toxizität der aPDT auf humane primäre PDL-Zellen mittels KVT und XTT-Assay. Die Ergebnisse zeigten, dass die Membranintegrität nach aPDT mit SAPYR mit verringerter Replikationsfähigkeit bei E. coli, nicht aber bei S. mutans und A. naeslundii
abgenommen hat. Lumineszenz- und Fluoreszenzmessungen zeigten nach aPDT mit SAPYR, dass die Stoffwechselaktivität verringert und die Bildung intrazellulärer ROS in allen drei Bakterienspezies erhöht war. Aufgrund dieser Ergebnisse ergab sich die Hypothese, dass es in Biofilmen durch die vermehrte Bildung intrazellulärer ROS zu einem Verlust der Replikationsfähigkeit nach aPDT mit SAPYR kommt. Die Proteinexpressionsanalysen mit planktonischen E. coli- Kulturen ergaben eine erhöhte Expression des Proteins RecA, welches bei der Schädigung der DNA aktiviert wird. Die Ergebnisse der RNA-Sequenzierung mit E. coli zeigten, dass es sowohl nach aPDT mit SAPYR als auch nach der Behandlung mit
CHX zu einer veränderten Expression von Genen an der bakteriellen Membran kam. Außerdem kam es zu einem erhöhten Abbau von Fettsäuren, was die Bildung von intrazellulären ROS bestärken kann. Die Auswertung der RNA-Sequenzierung mit S. mutans nach aPDT mit SAPYR und Behandlung mit CHX ergab eine erhöhte Expression von Genen, welche in Verbindung mit oxidativem Stress stehen sowie von Genen, welche eine Rolle in der Biofilmbildung spielen. Nach der Behandlung mit CHX kam es außerdem zur Regulation des PTS-Systems und von ABC-Transportern sowie der erhöhten Expression von Genen, welche mit der Antwort auf Säurestress zusammenhängen. Die Untersuchung der Toxizität der aPDT mit SAPYR auf humane PDL-Zellen zeigte, dass die Stoffwechselaktivität der Zellen konzentrations- und zeitabhängig signifikant abgenommen hat. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bieten einen Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen und verdeutlichen, dass die Aufklärung der Wirkmechanismen antimikrobieller Substanzen ebenso wichtig ist, wie die antimikrobielle Effektivität.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In view of the increasing number of bacterial resistances toward antibiotics, it is necessary to establish new antimicrobial methods with the aim of being able to replace the use of systemic as well as local antibiotics as far as possible. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is a promising alternative. The aim of this work was to investigate the mechanism of action and target structures of ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In view of the increasing number of bacterial resistances toward antibiotics, it is necessary to establish new antimicrobial methods with the aim of being able to replace the use of systemic as well as local antibiotics as far as possible. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is a promising alternative. The aim of this work was to investigate the mechanism of action and target structures of aPDT using SAPYR as photosensitizer. For this purpose, monospecies biofilms of Actinomyces naeslundii and Streptococcus mutans, as well as Escherichia coli, were first cultured, treated with aPDT and SAPYR at different concentrations and different incubation times, and then irradiated. The bacterial ability to replicate after aPDT was determined using a CFU assay. The integrity of the cytoplasmic membrane was measured by flow cytometry using SYBR Green and propidium iodide and visualized by scanning and transmission electron microscopy. Furthermore, luminescence and fluorescence measurements were used to investigate metabolic activity and the formation and intracellular ROS. Changes in protein and transcriptome expression in planktonic growing E. coli and S. mutans cultures after aPDT and treatment with CHX were investigated using Western blot and RNA sequencing. An investigation of the toxicity of aPDT on human primary PDL cells was performed using KVT and XTT assay. The results showed that aPDT with SAPYR led to membrane damage with decreased ability to replicate in E. coli, but not in S. mutans and A. naeslundii. Luminescence and fluorescence measurements showed that metabolic activity was decreased, and intracellular ROS formation was increased in all three bacterial species after aPDT with SAPYR. Based on these results, it was hypothesized that there is a loss of bacterial ability to replicate in biofilms due to the increased formation of intracellular ROS after aPDT with SAPYR. Protein expression analyses using planktonic E. coli cultures revealed increased expression of the protein RecA, which is activated upon DNA damage. RNA sequencing results with E. coli showed that aPDT with SAPYR and treatment with CHX resulted in altered expression of genes at the bacterial membrane. In addition, there was an increased degradation of fatty acids, which may reinforce the formation of intracellular ROS. Evaluation of RNA sequencing with S. mutans after aPDT with SAPYR and treatment with CHX revealed increased expression of genes related to oxidative stress and genes that play a role in biofilm formation. After treatment with CHX, regulation of the PTS system and ABC transporters, as well as increased expression of genes related to the response to acid stress occurred. The results of the toxicity of aPDT with SAPYR on human PDL cells showed that the metabolic activity of the cells decreased significantly in a concentration- and time-dependent manner. The results of the present work provide a starting point for further studies and highlight that elucidation of the mechanisms of action of antimicrobial agents is as important as antimicrobial efficacy.
Downloadstatistik