| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-382057
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.38205
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 22 Januar 2019 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Wolfram Gronwald |
| Tag der Prüfung: | 12 Dezember 2018 |
| Institutionen: | Medizin > Institut für Funktionelle Genomik > Lehrstuhl für Funktionelle Genomik (Prof. Oefner) |
| Stichwörter / Keywords: | Ataxia-Telangiectasia, Breast Cancer; c.7271T>G, Ionizing Radiation |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 38205 |
Zusammenfassung (Englisch)
Ataxia Telangiectasia - an autosomal recessive, multisystem disorder - is characterized by progressive cerebellar ataxia, telangiectasia, immune defects and a predisposition to malignancy and was first described in 1926 by Syllaba and Henner (Syllaba, L., Henner, K. 1926). The gene – Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) - was identified on chromosome 11q22-23 and up to now more than 350 different ...
Zusammenfassung (Englisch)
Ataxia Telangiectasia - an autosomal recessive, multisystem disorder - is characterized by progressive cerebellar ataxia, telangiectasia, immune defects and a predisposition to malignancy and was first described in 1926 by Syllaba and Henner (Syllaba, L., Henner, K. 1926). The gene – Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) - was identified on chromosome 11q22-23 and up to now more than 350 different mutations have been described. The ATM protein is a 350 kDa serine-threonine protein kinase that localizes mainly to the nucleus and plays a key role in the repair of DNA double strand breaks that are typically induced by ionizing radiation (IR). ATM is activated after IR-induced double strand breaks occur and subsequently phosphorylates many downstream targets that are involved in DNA damage repair mechanisms and cell cycle control. This activation cascade leads either to cell cycle arrest, repair of the DNA damage or induction of apoptosis. Disturbances in these mechanisms can result in an accumulation of DNA alterations that predispose the damaged cells to malignant transformation.
Since 1991, ATM has been discussed as a susceptibility gene for breast cancer (Swift et al. 1991), in particular the missense mutation c.7271T>G, p.Val2424Gly. For this missense variation a dominant-negative mechanism is described in the literature and in 2006 Waddell used expression profiles to discriminate c.7271T>G carriers from healthy controls (Chenevix-Trench et al. 2002; Waddell et al. 2006).
In the present study proteomics-based approaches in addition to different cell biological and biochemical investigations were used to elucidate the cellular reactions upon ionizing radiation of lymphoblastoid cell lines from A-T patients carrying different ATM-mutations with one AT patient homozygous for c.7271T>G, breast cancer patients heterozygous for c.7271T>G, and healthy controls.
FACS analysis could confirm already published data for a higher susceptibility to cell death and G1 arrest (f.e. (Bakkenist und Kastan 2003) for the cell lines derived from breast cancer patients harboring the heterozygous c.7271T>G variant upon IR. In contrast the Western Blot analysis could not confirm the dominant negative effect that was postulated by Chenevix-Trench and Waddell for the cell lines harbouring the heterozygous c.7271T>G substitution. In contrast to the published data the present study could show that downstream targets of ATM are still phosphorylated upon IR. The pedigree of the family A published 2002 by Chenevix-Trench shows that the breast cancer is inherited within the same haplotype, so there could be other factors accounting for this phenotype.
Two proteomics-based approaches, DIGE analysis and SWATH acquisition, were used to investigate the cellular response upon ionizing radiation for all cell lines. Two members of the ATM pathway –SMC1A and MRE11 – were significantly downregulation in the healthy control cell lines, with MRE11 also downregulated in the AT cell lines. A shift in the 2D gel of the phosphorylated proteins SMC1A and MRE11 would explain that downregulation upon irradiation. Additionally, the AT patients and control cell lines showed an upregulation of RAD23B – a protein involved in Nucleotide Excision Repair (NER) – upon IR in the SWATH approach, which was not present in the cell lines derived from breast cancer patients. The upregulation of RAD23B was also found in the AT patient cell line in the DIGE analysis. This regulation of RAD23B gives a first hint to a restricted function of NER and maybe DNA mismatch repair (MMR) in the cell lines derived from the breast cancer patients harbouring the c.7271T>G substitution. Additionally, the SWATH-MS approach showed a reduced regulation of proteins involved in NER and MMR in the c.7271T>G heterozygous cell lines compared to the controls. Therefore, these proteomics data show for the first time the postulated link between ATM and the MMR pathway ( (Romeo et al. 2011), which needs further investigation.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ataxia telangiectasia ist eine autosomal-rezessive vererbte Multisystemerkrankung, welche durch eine fortschreitende zerebelläre Ataxie, Teleangiektasien, Immundefekte und eine Prädisposition für Tumore gekennzeichnet ist. Sie wurde erstmals 1926 von Syllaba und Henner (Syllaba, L., Henner, K. 1926) beschrieben. Das Gen - Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) - liegt auf Chromosom 11q22-23 und ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ataxia telangiectasia ist eine autosomal-rezessive vererbte Multisystemerkrankung, welche durch eine fortschreitende zerebelläre Ataxie, Teleangiektasien, Immundefekte und eine Prädisposition für Tumore gekennzeichnet ist. Sie wurde erstmals 1926 von Syllaba und Henner (Syllaba, L., Henner, K. 1926) beschrieben. Das Gen - Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) - liegt auf Chromosom 11q22-23 und bisher wurden mehr als 350 verschiedene Mutationen beschrieben. Das ATM-Protein ist eine 350 kDa Serin-Threonin-Proteinkinase, die hauptsächlich im Zellkern lokalisiert ist. ATM spielt eine Schlüsselrolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, welche vor allem durch ionisierende Strahlung (IR) induziert werden. IR induzierte Doppelstrangbrüche führen zu einer Aktivierung von ATM, welches dann weitere Proteine - die an DNA-Reparaturmechanismen und Zellzykluskontrolle beteiligt sind – phosphorylieren kann. Diese Aktivierungskaskade führt entweder zum Zellzyklusarrest, zur Reparatur der DNA-Schäden oder zur Apoptose. Defekte in diesen Mechanismen können zu einer Anhäufung von Mutationen führen und somit zu einer möglichen Tumorentstehung beitragen.
Seit 1991 wird ATM als möglicher Risikofaktor für Brustkrebs diskutiert (Swift et al. 1991), insbesondere die Missense-Mutation c.7271T> G, p.Val2424Gly. Für diese Missense-Variante wird in der Literatur ein dominant-negativer Effekt beschrieben, und Waddell verwendete 2006 Expressionsprofile, um Mutationsträger der c.7271T>G-Variante von gesunden Kontrollen zu unterscheiden (Chenevix-Trench et al. 2002; Waddell et al. 2006).
In der vorliegenden Arbeit wurden neben verschiedenen zellbiologischen und biochemischen Untersuchungen auch Proteomik-basierte Ansätze verwendet, um die zelluläre Reaktion verschiedener lymphoblastoider Zelllinien (AT-Patienten mit verschiedenen ATM-Mutationen, eine AT-Patient homozygoten für c.7271T>G, Brustkrebspatienten heterozygot für c.7271T> G und gesunde Kontrollen) auf ionisierende Bestrahlung zu untersuchen.
Mittels FACS - Analysen konnte für die Zelllinien der Brustkrebspatienten nach Bestrahlung eine höhere Sterberate der Zellen sowie ein Arrest in der G1-Phase des Zellzyklus nachgewiesen – und somit bereits publizierte Daten (u.a. Bakkenist und Kastan 2003) bestätigt – werden. Die ebenfalls durchgeführten Western Blots konnten den dominanten negativen Effekt, den Chenevix-Trench und Waddell für die heterozygote c.7271T> G Substitution postulierten, nicht bestätigen: Im Gegensatz zu den publizierten Daten konnte die vorliegende Arbeit zeigen, dass Downstream-Targets von ATM nach Bestrahlung weiterhin phosphoryliert werden. Der Stammbaum der Familie A, der 2002 von Chenevix-Trench veröffentlicht wurde, zeigt, dass der Brustkrebs innerhalb des gleichen Haplotyps vererbt wird, so dass auch andere Faktoren für diesen Phänotyp verantwortlich sein können.
Um die zelluläre Reaktion auf ionisierende Bestrahlung bei allen Zelllinien zu untersuchen wurden zwei Proteomik-basierte Ansätze, DIGE und SWATH, verwendet. Zwei Downstream-Targets von ATM -SMC1A und MRE11- waren in den gesunden Kontrollzelllinien signifikant herunterreguliert, wobei MRE11 ebenfalls in den AT-Zelllinien herunterreguliert war. Eine möglicher Erklärung hierfür ist eine Phosphorylierung von MRE11 und SMC1A und demzufolge eine Verschiebung der Proteinspots auf dem 2D-Gel. Zusätzlich zeigten die Zelllinien der AT-Patienten und Kontrollen eine Hochregulation von RAD23B - einem Protein, das am Nucleotide Excision Repair (NER) Signalweg beteiligt ist. Diese Regulation konnte jedoch bei den Zelllinien der Brustkrebspatienten nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte eine Hochregulation von RAD23B auch in den Zelllinien der AT-Patienten mittels DIGE beobachtet werden. Dies ist ein erster Hinweis auf eine eingeschränkte Funktion des NER-Signalwegs und möglicherweise auch des MMR-Signalwegs in den Zelllinien der Brustkrebspatienten. Zusätzlich zeigten die SWATH-MS-Daten für die Zelllinien der Brustkrebspatienten eine reduzierte Regulation von Proteinen, die am NER- und MMR-Signalweg beteiligt sind. Mittels dieser Proteomdaten konnte erstmals die bereits publizierte Verbindung zwischen ATM und dem MMR-Signalweg ((Romeo et al. 2011)) auf zellulärer Ebene nachgewiesen werden, was durch weitere Experimente näher untersucht werden sollte.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 18:46
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