Die Lyme Borreliose ist eine bakterielle Infektionskrankheit, welche durch die Spirochäte B. burgdorferi sensu lato verursacht und über den Stich infizierter Zecken auf den Menschen übertragen wird. Während die Infektion in frühen Stadien klinisch gut diagnostiziert werden kann, zeigt sich die Erkrankung in den späteren Stadien mit unterschiedlichen Symptomen, was die klinische Diagnose deutlich ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Lyme Borreliose ist eine bakterielle Infektionskrankheit, welche durch die Spirochäte B. burgdorferi sensu lato verursacht und über den Stich infizierter Zecken auf den Menschen übertragen wird. Während die Infektion in frühen Stadien klinisch gut diagnostiziert werden kann, zeigt sich die Erkrankung in den späteren Stadien mit unterschiedlichen Symptomen, was die klinische Diagnose deutlich erschwert. Die bisher am weitesten verbreitete Labordiagnostik, um die klinische Diagnose zu sichern, ist der Nachweis spezifischer Antikörper gegen Borrelia. In der Regel wird hierzu ein zweistufiges Prinzip angewandt, bei welchem zunächst ein sensitiver Suchtest - meist ein ELISA- und zur Bestätigung ein spezifischer Test, häufig in Form eines Westernblots eingesetzt wird. Gerade in den späteren Stadien ist ein positiver serologischer Testausfall, durch die hohe Durchseuchungsrate in Endemiegebieten, oft wenig aussagekräftig. Es ist deshalb wünschenswert, eine weitere diagnostische Methode mit präziserer Aussage zur Krankheitsaktivität zu etablieren. Die spezifische T-Zell-Immunität gegen B. burgdorferi wurde bisher nur unzureichend untersucht. da hoch sensitive und spezifische Tests zur Analyse der T-Zell-Antwort noch fehlen. Ein bereits erfolgreich in der Tuberkulosediagnostik angewandtes Verfahren, welches den Nachweis von erreger-spezifischen Interferon-γ produzierenden T-Zellen erlaubt, stellt der Elispot dar. In meinen Untersuchungen wurde das Oberflächenantigen VlsE als mögliches Antigen für den Einsatz im Elispot identifiziert und zum Nachweis Borrelien-spezifischer T Zellen von Probanden erfolgreich eingesetzt. Vier Fragmente dieses Antigens sollten deshalb im Rahmen dieser Arbeit rekombinant hergestellt werden, um es im Anschluss für eine weitere Feinkartierung des Epitopes vergleichend im Elispot einzusetzen. Hierzu wurden die rekombinanten Antigene in Plasmidvektoren kloniert und mittels Sequenzierung auf dessen Richtigkeit erfolgreich überprüft. Nach Synthese der Proteine durch HEK 293T Zellen konnten diese mittels Westernblot, Elisa und weiteren Proteinfärbungen analysiert werden. Nachdem die hergestellte Proteinmenge für einen Einsatz im Elispot nicht ausreichend war, wurde auf Baculoviren als Expressionssystem gewechselt. Es gelang die Klonierung und Herstellung rekombinanter Baculoviren, sowie die Expression der Proteine und deren Nachweis und Aufreinigung. Versuche im Elispot zeigten, dass die weitere Expressionsoptimierung erforderlich ist, um mit ausreichend hohen Antigenmengen reproduzierbare T Zell Elispot-Tests durchzuführen und für den Einsatz in der Routinediagnostik der Lyme Borreliose zu validieren.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Lyme borreliosis is a bacterial infectious disease caused by the spirochete B. burgdorferi sensu lato and transmitted to humans through the bite of infected ticks.While the infection can be clinically well diagnosed in the early stages, the disease manifests in the later stages with different symptoms, making clinical diagnosis much more difficult. The most widely used laboratory diagnostics to ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Lyme borreliosis is a bacterial infectious disease caused by the spirochete B. burgdorferi sensu lato and transmitted to humans through the bite of infected ticks.While the infection can be clinically well diagnosed in the early stages, the disease manifests in the later stages with different symptoms, making clinical diagnosis much more difficult. The most widely used laboratory diagnostics to ensure clinical diagnosis is the detection of specific antibodies against Borrelia. As a rule, a two-stage principle is used for this, in which initially a sensitive screening test - usually an ELISA test and, for confirmation, a specific test, often in the form of a Westernblot, is used. A positive serological test result, especially in the later stages, is not diagnostically conclusive due to the high rate of infection in endemic areas. It is therefore desirable to establish another diagnostic method with more precise evidence of disease activity. Specific T cell immunity to B. burgdorferi has been insufficiently studied so far, since highly sensitive and specific tests for analyzing the T cell response are still missing. A method already successfully used in tuberculosis diagnostics, which allows the detection of pathogen-specific Interferon-γ-producing T cells, represents the Elispot. In my investigations, the surface antigen VlsE was identified as a possible antigen for use in Elispot and successfully used for the detection of Borrelia-specific T cells of volunteers. In context of this work, four fragments of this antigen should therefore be produced recombinantly, in order to use it in the Elispot for further fine mapping of the epitope. For this purpose, the recombinant antigens were cloned in plasmid vectors and successfully checked by means of sequencing for its correctness. After synthesis of the proteins by HEK293T cells, these can be analyzed by Westernblot, Elisa and other protein stains. After the amount of protein produced was insufficient for use in Elispot, baculoviruses were used as expression system. It succeeded in the cloning and production of recombinant baculoviruses, as well as the expression of the proteins and their detection and purification. Experiments in the Elispot showed that further expression optimization is necessary to carry out reproducible T cell Elispot tests with sufficiently high antigen quantities and to validate them for use in the routine diagnostics of Lyme borreliosis.
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