Untersuchungen zur Prägung naiver T-Zellen gegen potentielle HIV-Vakzinekandidaten in vitro

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-292640
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.29265

Käse, Janina

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 01 Dez 2014 17:08

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	1 Dezember 2014
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Ralf Wagner
Tag der Prüfung:	5 November 2013
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Stichwörter / Keywords:	HIV T-Zellen
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	29265

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Zusammenfassung (Deutsch)

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Trotz eines erheblichen Forschungsaufwandes ist es in den letzten 30 Jahren nicht gelungen, einen prophylaktischen Impfstoff gegen HIV zu entwickeln. Unter Umständen muss von der Idee Abstand genommen werden, eine HIV-Vakzine nach dem Modell bisher erfolgreicher viraler Vakzine entwickeln zu können, da herkömmliche Mechanismen zur Immunabwehr viraler Erkrankungen im Falle von HIV nicht funktionieren. Um mögliche Ansätze genauer zu untersuchen, bedarf es fundamentaler Grundlagenforschung. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, eine Methode zu etablieren, um die T-Zellimmunogenität potentielle Impfstoffkandidaten an primären T-Zellen in vitro zu testen. Als Vakzinekandidaten dienten Virus like particles (VLPs) die in Säugetier- und Insektenzellen produziert wurden.
Da die T-Helferzellantwort auf die effektive Antigenpräsentation durch Dendritische Zellen (DCs) angewiesen ist, wurde zunächst die Aufnahme von VLPs in DCs mit verschiedenen Methoden untersucht. VLPs wurden mit CFDA gefärbt und die Aufnahme in DCs nach 4 Stunden mittels Durchflusszytomtrie gemessen. Des Weiteren wurde das Gag-Gen an eine Sequenz für das Green-flourescent protein (GFP) gekoppelt und in einen DNA-Vektor eingebracht, der an menschlichen embryonalen Nierenzellen ausgetestet wurde. Es zeigte sich eine erfolgreiche Expression des Gag-GFP Genproduktes nach 4 bzw. 5 Tagen.
Anschließend wurde ein bereits bestehendes Verfahren zur Prägung naiver T-Zellen in vitro modifiziert und genutzt, um naive T-Zellen mit Hilfe von DCs gegen VLPs zu prägen und zu Th1 Zellen zu differenzieren. Nach 14 Tagen einer Kokultur erfolgte eine Restimulation der T-Zellen. Als Ausdruck einer Differenzierung der naiven T-Zellen zu reifen Th1 Zellen diente die Produktion des Zytokins IFN-γ dessen Produktion innerhalb der T-Zellen mittels Durchflusszytometrie gemessen wurde. Für 2 der 3 Spender konnte eine erfolgreiche Kultur über 14 Tage erfolgen. In beiden Spendern lag nach Stimulation der Anteil IFN-γ produzierender T-Zellen hochsignifikant über dem Niveau der unstimulierten Negativkontrollen. Es konnten demnach naive T-Zellen HIV-negativer Spender erfolgreich in vitro gegen VLPs geprägt, und zu Th1 Zellen differenziert werden.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

Despite 30 years of enormous effort in the field of HIV vaccine research it was not possible to develop a prophylactic HIV vaccine using traditional approaches. Since conventional mechanisms of immunological protection against viral infections are not succesfull in the case of HIV a broader fundamental understanding of the human immune system is necessary.
In this context the aim of the present thesis was to establish a method which qualifies potential HIV vaccines in a primary T-Cell culture. Virus like particles (VLPs) were produced in insect and mammalian cells and used as potential HIV-vaccine candidates. Since an effective T-cell response is highly dependent on an effective stimulation of T-cells by dendritic cells , experiments were performed to examine the uptake of VLPs into dendritic cells. First, VLPs were stained with CFDA and the uptake into dendritic cells was measured by the amount of fluorescent DCs after 4 hours of incubation using flow cytometry. Next, the HIV-Gag gene was genetically linked to a gene sequence for the so called “green-fluorescent-protein”. The construct was integrated in a DNA-Vector-System which was successfully tested in a Human Embryonic Kidney Cell -culture for measuring the amount of fluorescent cells after 4 or 5 days of culture.
Finally, an established method was modified and used in vitro to prime naïve humane T-cells against HIV 1-VLPs using dendritic cells for antigen presentation. On day 14 of the coculture the production of IFN gamma in the T-cells was measured as a display of their reaction to a stimulation with HIV-1 VLPs. Once again cells were examined using flow cytometry. In 2 out of 3 donors a culture could be successfully established over 14 days. In those 2 donors the amount of T-cells producing interferon gamma was significantly higher if stimulated T-cells were compared with the unstimulated negative control. Thus it could be demonstrated that naïve T-cells of HIV-negative donors were primed against HIV-VLPs in a culture setting.

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