Dissecting the role of adaptor protein complex 4 (AP-4) on development and protein sorting in Arabidopsis thaliana
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Abstract
The heterotetrameric adaptor protein complexes (AP-1 to AP-5) represent essential components of the protein sorting machinery in all eukaryotes. Nevertheless, the role of AP-4 remains comparatively poorly understood. Through fundamental characterization of Arabidopsis loss-of-function mutants and examination of subcellular targeting of numerous transmembrane proteins, this work aims to provide further insights into AP-4 dependent sorting processes and its effects on plant development. In addition to Arabidopsis mutants either deficient for one of the large (AP4ß), or the medium (AP4µ) subunit of the complex, a corresponding double mutant line was established. Comparison of the different mutant lines with wildtype plants subsequently revealed that AP-4 affected plant growth throughout different developmental stages. More precisely, ap4 mutants showed reduced growth of roots and of etiolated hypocotyls, and developed abnormal leaf trichomes with aberrant branches. Moreover, mutation of AP-4 subunits severely impaired pollen tube growth in vitro, and, correspondingly, reduced paternal transmission of the mutant alleles in vivo. Furthermore, ap4 mutants showed defects in primary shoot growth, with a concomitant disruption of apical dominance. While auxin is known to suppress the outgrowth of lateral buds in the wild-type, the abnormal shoot growth of the mutant was not found to be associated with an altered distribution of the plant hormone. Further, disruption of AP-4 subunits altered the concentration of myo-inositol, glucose and fructose, and resulted in chlorosis, accompanied by a reduced chlorophyll content in mutant seedlings compared to the wildtype. Overall, the double mutant as well as the single mutants, showed a highly pleiotropic, but identical phenotype, suggesting that the functionality of the complex is completely disrupted in the absence of any of the subunits. Importantly, stable reintroduction of AP4µ fused to -GUS or -GFP, expressed under control of an AP4µ-promoter fragment, completely restored the wildtype phenotype in ap4µ mutant plants. In agreement with other recently published data, AP4µ-GFP was localized to small punctate intracellular compartments. Promoter activity was detected almost ubiquitously throughout plant growth, but markedly peaked in newly developing tissue, which was overall consistent with the various defects observed in the loss-of-function mutants. Finally, live cell imaging of Arabidopsis mesophyll protoplasts transiently overexpressing fluorophore-fusions of potential cargos, revealed that the subcellular distribution of several transmembrane proteins was drastically altered in the absence of a functional AP-4 complex. For one, the absence of AP-4 impaired sorting of a fluorescently labeled aquaporin, GFP-PIP2;1, to the plasma membrane. And secondly, possibly correlating with the chlorotic appearance of ap4 mutants, tonoplast targeting of GFP-fusions of the metal-ion transporters NRAMP3 and NRAMP4, as well as of the molybdate transporter MOT2, was substantially disturbed in the absence of AP-4. Colocalization studies further demonstrated a partial relocation of these proteins to the plasma membrane in ap4 mutants. In contrast, targeting of a GFP-fusion of inositol transporter INT1 to the vacuolar membrane was not affected by mutations in AP-4. This observation, in turn, confirmed that missorting of NRAMP3-, NRAMP4, or MOT2-GFP in the ap4 mutants was specific, and not due to a general disruption of tonoplast targeting. Altogether, these results are the first to demonstrate that AP-4 affects subcellular sorting of specific vacuolar transmembrane proteins. Closer inspection of the mechanisms behind sorting of NRAMP3 and NRAMP4 additionally revealed that tonoplast localization of each of the proteins strictly required a dileucine-based motif within their amino acid sequence. Finding that exchange of the critical leucine-pair for an alanine-duplet, or disruption of the AP-4 complex, both induced relocation of the metal-ion transporters to the plasma membrane, finally allowed for the hypothesis of a direct participation of the AP-4 complex in dileucine motif dependent protein sorting in the plant system.
Abstract
Die heterotetrameren Adapter Protein Komplexe (AP-1 bis AP-5) repräsentieren essentielle Komponenten der eukaryotischen Proteinsortierungsmaschinerie. Nichtsdestotrotz ist die Rolle des AP-4 Komplexes, insbesondere im pflanzlichen System, nach wie vor noch verhältnismäßig wenig untersucht. Eine grundlegende Charakterisierung entsprechender Arabidopsis Funktionsverlustmutanten und die Untersuchung der subzellulären Verteilung von zahlreichen Transmembranproteinen, sollten daher im Rahmen der vorliegenden Studie Einblicke in AP-4-abhängige Sortierungsprozesse und deren Auswirkungen auf die pflanzliche Entwicklung geben.
Zusätzlich zu Einzelmutanten, in denen jeweils entweder die Expression einer der großen Untereinheiten (AP4ß), oder die der mittleren Untereinheit (AP4µ) des AP-4 Komplexes durch T-DNA Insertion verhindert war, wurde die entsprechende Doppelmutante generiert. Der Vergleich der verschiedenen Mutantionslinien zum Wildtyp machte anschließend deutlich, dass der Komplex das Pflanzenwachstum über die verschiedenen Entwicklungsstadien hindurch beeinflusst. Konkret äußerte sich dies bei den Mutanten in einem reduzierten Wachstum von Wurzeln und von etiolierten Hypokotylen, sowie in der Entwicklung morphologisch abnormaler Trichome. Außerdem waren Mutationen in den Untereinheiten von AP-4 in vitro mit einer massiven Beeinträchtigung des Pollenschlauchwachstums verbunden. In Übereinstimmung hierzu, konnte auch in vivo eine verminderte paternale Transmission der einzelnen Mutanten-Allele, jeweils in Konkurrenz zum Wildtyp-Allel, festgestellt werden. Weiterhin zeigten Mutanten Störungen in der primären Sprossentwicklung, sowie eine häufig damit einhergehende Aufhebung der Apikaldominanz. Während Auxin zwar bekanntermaßen an der normalerweise stattfindenden Unterdrückung des Seitentriebwachstums beteiligt ist, konnte die abnormale Sprossentwicklung der Mutanten nicht auf eine veränderte Verteilung dieses Pflanzenhormons zurückgeführt werden. Abgesehen davon, führten Mutationen in Untereinheiten von AP-4 im Vergleich zum Wildtyp zu einem veränderten Gehalt an myo-Inosit, Glukose und Fruktose, sowie zu Chlorose, verbunden mit einer durch Eisenmangel zusätzlich verstärkten Reduktion des Chlorophyllgehalts. Insgesamt zeigten sowohl die Doppelmutanten, als auch die Einzelmutanten also einen zwar stark pleiotropen, aber dennoch identischen und im Hinblick auf die einzelnen Aspekte gleich stark ausgeprägten Phänotyp. Dies implizierte, dass der Komplex bereits in Abwesenheit einer der Untereinheiten nicht mehr funktional ist. Darüber hinaus konnte in ap4µ Mutanten, durch stabile Expression der mit -GFP oder -GUS fusionierten, genomischen AP4µ-Sequenz unter Kontrolle eines AP4µ-Promoterfragments, ein zum Wildtyp identischer Phänotyp vollständig wiederhergestellt werden. In der entsprechenden Komplementationslinie konnte AP4µ-GFP anschließend an kleinen, punktförmigen, intrazellulären Strukturen detektiert werden, was mit den Ergebnissen einer kürzlich veröffentlichen Studie konform ist, in der AP4µ am trans-Golgi Netzwerk nachgewiesen werden konnte. Promotoraktivität ließ sich weiterhin beinahe ubiquitär über das gesamte Wachstum hinweg detektieren, zeigte dabei jedoch vor allem in jungem Gewebe deutliche Maxima, was sich insgesamt mit der Polyphänie der Funktionsverlustmutanten deckte.
Im weiteren Verlauf der Arbeit, sollten Transmembranproteine identifiziert werden, die AP-4-abhängigen Sortierungsmechanismen unterliegen. Dazu wurden Fluorophor-Fusionen zahlreicher potentieller Cargos generiert und diese jeweils transient in Arabidopsis Mesophyllprotoplasten überexprimiert. Nach konfokalmikroskopischer Untersuchung konnten so später diejenigen Fusions-Proteine identifiziert werden, deren subzelluläre Verteilung in Abhängigkeit von AP-4 verändert war. In ap4 Mutanten war hierbei im Vergleich zum Wildtyp zum einen die Sortierung eines fluoreszenzmarkierten Aquaporins, GFP-PIP2;1, zur Plasmamembran beeinträchtigt. Zum anderen zeigten mehrere, im Wildtyp am Tonoplasten lokalisierte Proteine, eine deutliche Verschiebung zu anderen Kompartimenten. So war in Abwesenheit des Komplexes, möglicherweise in Zusammenhang mit der in ap4 Mutanten beobachteten Chlorose, sowohl die Sortierung von GFP-Fusionen der Metallionentransporter NRAMP3 und NRAMP4, als auch die des Molybdattransporters MOT2 zur Vakuolenmembran substanziell gestört. Weiterhin bestätigten Kolokalisationsstudien eine partielle Umsteuerung dieser Proteine zur Plasmamembran der Mutante. Im Gegensatz dazu, zeigte eine GFP-Fusion des Inositoltransporters INT1 in ap4 Mutanten keinerlei Beeinträchtigung in Bezug auf die Sortierung zum Tonoplast. Das wiederum machte deutlich, dass die Umsteuerung von NRAMP3-, NRAMP4- und MOT2-GFP in der ap4 Mutante spezifisch, und nicht auf eine generelle Störung der Proteinsortierung zur Vakuole zurückzuführen war. Eine genauere Untersuchung von Mechanismen hinter der Sortierung von NRAMP3 und NRAMP4 zeigte außerdem, dass der Transport der beiden Proteine zum Tonoplasten jeweils streng von einem dileucin-basierten Motiv in deren Peptidsequenz abhängig war. Die Beobachtung, dass sowohl der Austausch des kritischen Leucinpaars gegen ein Alanindublett, als auch die Abwesenheit eines funktionalen AP-4 Komplexes, jeweils eine Umsteuerung der Metallionentransporter zur Plasmamembran zu Folge hatte, erlaubte schließlich die Hypothese einer direkten Beteiligung des AP-4 Komplexes bei der dileucin-motiv-abhängigen Proteinsortierung im pflanzlichen System.
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pre-peer reviewed Version folgender Publikation: doi: 10.1111/tra.12567