Die Bedeutung Adenosin-abhängiger Signalkaskaden in präklinischen Modellen der systemischen Sklerose

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2016-04-14
Issue Year
2016
Authors
Layritz, Florian
Editor
Abstract

Objectives: Systemic sclerosis (SSc) is a systemic, autoimmune mediated, orphan disease with significantly increased mortality. The hallmarks of the disease are vascular changes such as loss of capillaries and remodeling of the pulmonary arteries and tissue fibrosis due to increased release of collagen from pathological activated fibroblasts. This increased collagen production is caused e.g. by adenosine triggered activation of the A2A-Receptor. The tissue level of extracellular adenosine is mainly controlled by the enzyme adenosine deaminase (ADA). Mice with deficiency in ADA have increased levels of endogenous adenosine and develop systemic fibrotic manifestations. These fibrotic changes were prevented by treatment with an A2A-receptor antagonist. Aim of this study was, to evaluate the effect of exogenous recombinant ADA in murine models of SSc. Methods: The efficiency of recombinant ADA was examined in two murine models. The first model was a model of chronic-graft-versus-host-disease (cGvHD) induced by allogenic bone marrow transplantation with a mismatch in minor histocompatibi-lity antigens. The effects of treatment with recombinant adenosine deaminase were analyzed with clinical, histological and biochemical readouts. Skin sections were stained with Hematoxylin and eosin (HE) to quantify dermal thickening and stained for α-smooth muscle actin (αSMA) to identify myofibroblasts. The collagen content in skin was determined by hydroxyproline assays. Clinical changes were assessed using an established score for cutaneous cGvHD. As a second model, we analyzed Fos-related-antigen-2 (Fra-2) transgenic mice. Fra-2 is a transcription factor of the Activator-Protein-1 (AP-1)-family. The transgenic overexpression of Fra-2 results in fibrosis of the skin and lungs. In addition, Fra-2 transgenic mice develop SSc-like vascular manifestations with pulmonary-arterial hypertension like changes. Fibrotic changes were assessed by determination of dermal thickness (skin) and of the Sirius Red stained area (lungs), by assessment of myofibroblast counts and by quantifica-tion of the hydroxyproline content. Vascular changes were analyzed by assessment of the average thickness of the vessel walls of pulmonary arteries and by counting the number of highly narrowed vessels.
Results: In both models treatment with recombinant adenosine deaminase exerted anti-fibrotic effects. In the cGvHD model, preventive treatment with recombinant ADA ameliorated fibrotic manifestations with decreased dermal thickening, reduced myofibroblast counts and lower hydroxyproline content. Treatment with recombinant ADA also reduced the cutaneous cGvHD score. Treatment with recombinant ADA also ameliorated dermal and pulmonary fibrosis in Fra-2 transgenic mice. Moreover, pulmonary arterial remodeling was reduced. The average thickness of the vessel wall in pulmonary arteries was reduced and less highly narrowed pulmonary arteries were detected. Adverse events of the treatment were not observed in the two models. Conclusions: The present study demonstrates that recombinant ADA ameliorates both vascular and fibrotic changes in two murine models of SSc. These results further highlight the role of adenosine signaling in the pathogenesis of systemic sclerosis and may provide first evidence that recombinant ADA may be a potential treatment option for SSc.

Abstract

Hintergrund und Ziele der Arbeit: Bei der systemischen Sklerose (SSc) handelt es sich um eine autoimmun-vermittelte seltene Krankheit mit signifikant erhöhter Sterblichkeit. Die Kennzeichen dieser Erkrankung sind u.a. der Verlust von Kapillaren, die Umformung von Lungenarterien und eine Gewebefibrose aufgrund einer erhöhten Kollagenproduktion pathologisch aktivierter Fibroblasten. Diese vermehrte Produktion von Kollagen beruht unter anderem auf einer durch Adenosin gesteuerten Aktivierung des A2A-Rezeptors. Der Gewebespiegel von extrazellulärem Adenosin wird hauptsächlich durch das Enzym Adenosin-Desaminase (ADA) gesteuert. Tierexperimentelle Studien zeigten, dass Mäuse mit einem Mangel an ADA einen daraus resultierenden Anstieg von endogenem Adenosin haben und eine Fibrose in der Haut, der Lunge und anderen Organen entwickelten, welche durch Gabe eines A2A-Rezeptor-Antagonisten verhindert werden konnte. Ziel dieser Arbeit war es, anhand tierexperimenteller Mausmodelle die Wirkung rekombinanter Adenosin-Desaminase (r-ADA) bei der Entstehung und der Therapie einer SSc zu beurteilen. Methoden: Die Wirksamkeit r-ADA wurde anhand zweier verschiedener Mausmodelle untersucht. Zuerst wurde die Wirksamkeit r-ADA anhand eines Mausmodells der sklerodermiformen chronischen Graft-versus-Host-Erkrankung (cGvHD) analysiert. Mittels allogener Stammzelltransplantation bei sich in minor histocompatibility Antigenen unterscheidenden Mäusen wurden klinische und histopathologische Symptome einer cGvHD induziert und die Wirksamkeit einer nach Transplantation beginnenden Behandlung mit r-ADA hinsichtlich Krankheitsverlauf und Ausprä-gungsgrad untersucht. Hierzu wurden Hautschnitte zur Bestimmung der Hautdicke histologisch gefärbt, die Anzahl der Myofibroblasten wurde immunhistologisch untersucht. Ein Hydroxyprolin-Assay diente zur Quantifizierung des Kollagengehaltes. Der Krankheitsverlauf wurde anhand einer zuvor definierten klinischen Bewertung zusammen mit dem Körpergewicht täglich ab Stammzelltransplantation erhoben. In einem zweiten Modell wurde die Wirksamkeit von r-ADA bei Fos-related-antigen-2 (Fra-2) transgenen Mäusen untersucht. Fra-2 ist ein Transkriptionsfaktor der Aktivator-Protein-1 (AP-1)-Familie, dessen transgene Überexpression zu Haut- und Lungenfibrose und Gefäßveränderungen (Lungenarterienstenose sowie Gefäßwandverdickung) führt, welche charakteristische Symptome einer SSc sind. Die Wirksamkeit der Therapie mit r-ADA wurde in der Haut und Lunge untersucht. Die analysierten Punkte der Haut und der Lunge waren denen der cGvHD identisch. Zusätzlich erfolgte eine Beurteilung der Lungenfibrose und der Veränderungen von Lungenarterien mit Hilfe von histologischen Färbungen. Ergebnisse und Beobachtungen: In beiden Modellen zeigte die Gabe von r-ADA antifibrotische Effekte. Im Modell der cGvHD linderte diese sowohl den Krankheits-verlauf als auch den Grad der Krankheitsausprägung. So zeigten mit r-ADA behandelte Mäuse eine geringere Hautdicke, eine geringere Anzahl an Myofibroblasten in der Haut sowie einen niedrigeren Kollagenhalt. Bei den Fra-2 transgenen Mäusen be-wirkte eine Therapie mit r-ADA eine Besserung der Haut und Lungenfibrose. Durch Gabe von r-ADA konnte die Anzahl an Myofibroblasten und die Kollagenmenge in Haut und Lunge gesenkt werden, was die Abnahme fibrotischer Lungenbereiche sowie der Hautdicke widerspiegelt. Der Umbau der Lungenarterien mit Verdickung der Gefäßwand wurde ebenfalls reduziert. So zeigten sich durch die Therapie weniger stark stenosierte Pulmonalarterien und dünnere Gefäßwände. Nebenwirkungen der Therapie wurden in beiden Modellen nicht beobachtet. Praktische Schlussfolgerungen: Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in beiden Maus-modellen der SSc die Gabe von r-ADA sowohl vaskuläre als auch fibrotische Veränderungen reduzieren kann. Diese Ergebnisse liefern weitere Hinweise auf die zentrale Bedeutung Adenosin-abhängiger Signalkaskaden in der SSc und zeigen, dass die Gabe von r-ADA ein möglicher Behandlungsansatz sein könnte.

DOI
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