The mycobacterial cord factor trehalose-6,6’-dimycolate (TDM) is an abundant cell wall glycolipid of Mycobacterium tuberculosis and other mycobacteria. It causes inflammation and adjuvanticity, but it is also a major virulence factor of M. tuberculosis. Its synthetic analogue trehalose-6,6’-dibehenate (TDB) has robust adjuvant activity and induces a Th1/Th17 T cell response in animal models. The TDB-containing liposomal adjuvant formulation Caf01 has entered phase I clinical studies in humans. In mice, the C-type lectin receptors (CLRs) MINCLE and MCL act as sensors for TDB and TDM and activate macrophages and dendritic cells (DC) through the SYK-CARD9 pathway. Yet, little is known about the interaction of human antigen-presenting cells (APC) with TDB and TDM; the question remains open whether the same pathway is engaged. We established an in vitro model to characterize the inflammatory response of primary human monocytes, macrophages and DC to TDB and TDM stimulation. TDB/TDM stimulation induced a robust release of chemokines and cytokines, while the pattern of response was dependent on stimulus and cell type. Whereas monocytes and GMCSF-derived macrophages secreted comparable amounts of chemokines and cytokines when stimulated with TDB and TDM, in MCSF-derived macrophages and DC the response was markedly dependent on the stimulus. Hypothesizing that the receptors for TDB/TDM recognition would be conserved in mice and humans, we analyzed requirements for SYK and CARD9 expression and activity, and demonstrated that they were necessary for glycolipid-induced IL8 secretion. In human monocytes and macrophages mRNA expression of MINCLE and MCL was high. Moreover, we could detect MINCLE and MCL protein with predominantly intracellular localization in resting cells. We found no upregulation of MINCLE mRNA expression induced by MCL, as it has been described in mice; induction by stimulation was weak. This suggests a different expression pattern of the receptors in mouse and man. Regarding the functionality of MINCLE and MCL, IL8 production of GMCSF-derived macrophages in response to glycolipid stimulation was partially reduced after siRNA knockdown. In turn, genetic complementation of human MINCLE, but not MCL, in murine MINCLE-deficient DC was sufficient to restore their responsiveness to TDB/TDM stimulation. Furthermore, human MINCLE showed dose-dependent binding to TDB and TDM. In this comprehensive study, we could demonstrate that in human innate immune cells dependent on the SYK-CARD9 pathway the CLR MINCLE contributes to recognition of TDB/TDM, while the role of MCL remains less clear. These findings will help to better understand the interaction of mycobacteria with immune cells and to interpret the results of the first clinical trials with the prototypic liposomal adjuvant Caf01.

Der mykobakterielle Cord-Faktor Trehalose-6,6’-dimycolate (TDM) ist das häufigste Glykolipid in der Zellwand von Mycobacterium tuberculosis und anderen Mykobakterien. TDM ist ein wichtiger mykobakterieller Virulenzfaktor, wirkt jedoch auch als Adjuvans. Ein synthetisches Analogon von TDM, Trehalose-6,6’-dibehenate (TDB), zeigt in Tiermodellen Adjuvanswirkung und vermittelt eine Th1/Th17 T-Zell-abhängige Immunantwort. Das liposomale Adjuvans Caf01 enthält TDB und wird derzeit in klinischen Phase-I-Studien erprobt. In Mäusen fungieren die C-Typ Lektin-Rezeptoren (CLRs) MINCLE und MCL als Rezeptoren für TDB und TDM und können Makrophagen und Dendritische Zellen (DC) abhängig vom SYK-CARD9 Signalweg aktivieren. Über die Interaktion humaner Antigen-präsentierenden Zellen (APC) mit TDB und TDM ist bisher wenig bekannt. Um die Reaktion von humanen Monozyten, Makrophagen und DC auf TDB und TDM zu untersuchen, wurde ein in vitro-Stimulationsmodell etabliert. Stimulation mit TDB/TDM führte zu stimulus- und zelltyp-abhängiger Sekretion von Zytokinen und Chemokinen. In der Annahme, dass die Rezeptoren für TDB/TDM-Erkennung in Maus und Mensch konserviert sind, wurde untersucht, ob Expression und Aktivität von SYK und CARD9 für die Antwort erforderlich sind. In der Tat zeigte sich, dass die Glykolipid-induzierte Sekretion von IL8 abhängig von SYK-CARD9 ist. Die mRNA-Expression von MINCLE und MCL in humanen Monozyten und Makrophagen war hoch. MINCLE und MCL Protein war in ruhenden Zellen überwiegend intrazellulär lokalisiert. Anders als in Mäusen beschrieben, wurde nach Stimulation keine Hochregulation der MINCLE mRNA-Expression, und nur eine geringe Änderung der Proteinexpression beobachtet; dies deutet auf grundsätzliche Expressionsunterschiede in Maus und Mensch hin. Im Hinblick auf die Funktionalität der Rezeptoren, führte der siRNA-Knockdown von MINCLE und MCL in GMCSF-differenzierten Makrophagen zu einer partiellen Reduktion der IL8-Antwort auf Glykolipid-Stimulation. Zusätzlich konnte die retrovirale Transduktion von humanem MINCLE, aber nicht von MCL, in murine MINCLE-defiziente DC die Antwort auf TDB/TDM-Stimulation wieder herstellen. Eine dosisabhängige Bindung von humanem MINCLE an TDB/TDM wurde nachgewiesen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der humane MINCLE Rezeptor in Abhängigkeit vom SYK-CARD9-Signalweg an der Erkennung von TDB/TDM beteiligt ist. Die Rolle von Mcl für die Glykolipid-Erkennung ist noch nicht vollständig geklärt. Die Ergebnisse tragen dazu bei, die Interakion humaner Immunzellen mit Mykobakterien besser zu verstehen, und helfen, die Ergebnisse der klinischen Studien mit dem prototypischen liposomalen Adjuvans Caf01 zu interpretieren.