Interindividuell unterschiedlich ausgeprägte Induktion der Apoptose und Nekrose bei Bestrahlung, Chemotherapie und Hyperthermie von Lymphozyten im Blut von Tumorpatienten
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Background and objectives Individual differences in the intensity of therapeutic response to radio- and chemotherapy pose a major challenge of these treatment options. If there is a reliable, fast and cheap in vitro test to assign patients pre-treatment in a group considering their susceptibility, it is possible to improve the patient’s well-being as well as treatment success, as on the one hand higher doses could be possible and on the other hand discontinuation of treatment due to overreactions to the treatments. One way to make this decision is by measuring apoptotic rates of lymphocytes. In this study the way the different lymphocyte subgroups respond to irradiation, chemotherapeutics and hyperthermia and differences in response of patients’ and the control groups’ lymphocytes to these treatments was examined and if there were individual levels of susceptibility regarding these treatments as well as if it is possible to estimate a patient’s prognosis considering its apoptotic or necrotic rates. Methods The lymphocytes were isolated pre-treatment out of whole peripheral blood of 111 patients suffering from colorectal cancer (CRC) and of 26 healthy controls. Evaluating the correlations and Kaplan Meier curves we used data of 87 CRC 4 patients, as their clinical data was fully available. Some samples were irradiated with 2 Gy, some with 8 Gy, some treated with 5-Fluorouracil, some with Oxaliplatin, some were treated with a combination of 2 Gy and 5-Fluorouracil, some with 2 Gy and Oxaliplatin, some were exposed to 42 °C and some to 43 °C hyperthermia for an hour in a water bath. Subsequently, these samples were stored in an incubator for 48 hours, afterwards dyed with immunofluorescent Annexin V and 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) and then the apoptotic and necrotic rates were measured by flow cytometry. Results and observations There were found individual differences as well as differences between the patients’ and control groups’ apoptotic and necrotic rates when treated with irradiation, chemotherapeutics or hyperthermia. Especially CD8+ lymphocytes showed an even and proportional response to these different stimuli, while this is not as clearly seen particularly with CD4+ and CD20+ cells’ necrotic rates. When dividing the patients into two groups with one having a CD8+ cells’ apoptotic rate above the median and the other one having a lower one, the Kaplan Meier curves showed differences of the patients’ prognosis regarding metastasis and disease-free survival. The higher apoptotic rate of CD8+ lymphocytes proved to be beneficial. Similar results were found with necrotic rates of CD20+ cells. An above median rate of necrosis after treatment with 43 °C hyperthermia was beneficial regarding metastasis (p = 0.035), survival (p = 0.017) and tumor-specific survival (p = 0.085), while significance was narrowly missed with recurrence (p = 0.085) and disease-free survival (p = 0.055). Conclusion Our study suggests that the patients‘ lymphocytes are in a weakened condition as they already show higher apoptotic and necrotic rates compared to the control groups’ cells when left untreated. This effect should be kept in mind as this means, that there are less cells left that could show a form of cell death in response to the treatments. Furthermore, considering the correlations of apoptotic and necrotic rates of the lymphocytes individual differences in response to the treatments is seen, particularly the CD8+ cells show a significantly proportional response to these 5 stimuli. For example, when they show high rates of apoptosis upon being irradiated with 2 Gy they probably will display high apoptotic rates when treated with Oxaliplatin (p < 0.001), while this effect is not found with CD4+ cells (p = 0.230). Of particular interest are the results of the Kaplan Meier method. It is possible to estimate a patient’s prognosis regarding metastasis and disease-free survival by looking at the apoptotic rates of CD8+ lymphocytes after irradiation with 2 Gy, 8 Gy, and the combination of 2 Gy and Oxaliplatin and assigning the patient to either the group showing above or below median apoptotic rates. Results regarding overall survival can be expected to be shown after a longer follow-up period. The higher necrosis rate of CD20+ cells when treated with 43 °C hyperthermia already shows a favorable prognosis regarding metastasis (p = 0.035), overall survival (p = 0.017) and tumor-specific survival (p = 0.010).
Abstract
Hintergrund und Ziele Ein großes Problem von Bestrahlungen und Chemotherapien ist das individuell unterschiedlich ausgeprägte Ansprechen der Patienten auf diese Behandlungsmodalitäten. Gibt es eine zuverlässige, schnelle und günstige Methode durch in vitro Tests die Patienten vor der Therapie einer ihrer Strahlenempfindlichkeit berücksichtigenden Behandlungsgruppe zuzuführen, kann man nicht nur das Wohlergehen des Patienten, sondern auch den Behandlungserfolg verbessern, da so einerseits höhere Bestrahlungsdosen möglich sein können, andererseits Behandlungsabbrüche bei Überreaktionen verhindert werden können. Eine Möglichkeit diese Entscheidung zu treffen stellt die Messung der Apoptose von Lymphozyten dar. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie verschiedene Lymphozytenuntergruppen auf Bestrahlung, Chemotherapeutika und Hyperthermie reagieren, wie sich die Apoptoseraten von an Krebs erkrankten Patienten und gesunden Kontrollpersonen unterscheiden, ob es individuelle Unterschiede der Sensibilität gegenüber diesen Behandlungen gibt und ob man anhand der Zelltodraten die Prognose des Patienten einschätzen kann. Methoden Vor Therapiebeginn wurden Lymphozyten aus dem Blut von 111 Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) und 26 gesunden Kontrollpersonen isoliert. Für die Korrelationen und die Kaplan Meier Kurven beschränkten wir uns auf die 87 Patienten deren klinische Daten vollständig zur Verfügung standen. Ein Teil des Blutes der Patienten wurde mit 8 Gy bestrahlt, einer mit 2 Gy, einer nur mit 5-Fluorouracil oder Oxaliplatin versetzt, einer nach gerade genanntem Chemotherapeutikaschema behandelt und zusätzlich mit 2 Gy bestrahlt, einer bei 42 °C und ein letzter Teil bei 43 °C für eine Stunde im Wasserbad belassen. Anschließend wurden diese Proben 48 Stunden im Brutschrank inkubiert und danach per Immunfluoreszenzfärbung mit Annexin V und 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) und Durchflusszytometrie die Apoptose und Nekrose bestimmt. Ergebnisse und Beobachtungen Es lassen sich sowohl interindividuelle Unterschiede als auch Unterschiede zwischen Kontroll- und Patientengruppe bei Apoptose- und Nekroseraten auf Bestrahlung, Chemotherapeutika und Hyperthermie feststellen. Außerdem zeigen besonders die CD8+ Lymphozyten ein gleichmäßiges und proportionales Ansprechen auf verschiedene Reize, während es bei den CD4+ und CD20+ Zellen vor allem bei den Nekroseraten deutliche Unterschiede gibt. Bei den Kaplan Meier Überlebensraten zeigten sich signifikante Unterschiede der Prognose der Patienten hinsichtlich der Metastasierung und dem krankheitsfreien Überleben, wenn man die Patienten in zwei Gruppen unterteilt mit einer Apoptoserate der CD8+ Zellen über und einer unter dem Median. Die Patienten, deren CD8+ Lymphozyten mehr Apoptose aufwiesen hatten dabei die günstigere Prognose. Ähnliche Ergebnisse konnten bei der Nekrose der CD20+ Zellen gefunden werden. So unterscheiden sich die Gruppen hoher und niedriger Nekrose bei der Hyperthermie mit 43 °C hinsichtlich der Metastasierung (p = 0,035), des Überlebens (p = 0,017) und des tumorspezifischen Überlebens (p = 0,010), wobei eine Signifikanz im Hinblick auf Rezidivierung (p = 0,085) und krankheitsfreiem Überleben (p = 0,055) nur knapp verfehlt wird. Schlussfolgerungen Die Lymphozyten der Patientengruppe sind anscheinend bereits etwas angeschlagen, da sie bereits bei den unbehandelten Kontrollversuchen eine höhere Apoptose und Nekrose aufweisen als die Zellen der Kontrollpersonen. Dies sollte man nicht außer Acht lassen, da so einige Zellen bereits zugrunde gegangen sind, die dann bei anderen Versuchen nicht mehr auffallen. Des Weiteren kann man bei den Korrelationen der Apoptoseraten der Lymphozytenuntergruppen eine individuelle Sensibilität auf die Behandlungen erkennen, vor allem die CD8+ Zellen reagieren proportional stark auf die Reize. Zeigt sich bei ihnen viel Apoptose bei einer Bestrahlung mit 2 Gy, so ist auch mehr Apoptose bei der Behandlung mit Oxaliplatin zu erwarten (p < 0,001), während dieser Effekt bei den CD4+ Lymphozyten beispielsweise nicht zu sehen ist (p = 0,230). Besonders interessant ist der Vergleich der Prognose anhand Kaplan Meier Kurven. So kann man mittels der Apoptose der CD8+ Zellen bei Bestrahlung mit 2 Gy, 8 Gy und der Kombination aus 3 2 Gy und Oxaliplatin auf die Metastasierung und das krankheitsfreie Überleben schließen, wenn man die Patienten einer von zwei Gruppen zuteilt, wobei eine Gruppe Apoptosewerte über dem Median und eine Gruppe unter dem Median besitzt. Bei längerer Nachbeobachtungszeit könnten sich auch Signifikanzen bezüglich des allgemeinen Überlebens zeigen. Bei der Nekroserate der CD20+ Lymphozyten bei Hyperthermie mit 43 °C zeigen sich hierbei aber bereits jetzt Unterschiede hinsichtlich nicht nur der Metastasierung (p = 0,035), sondern auch des Überlebens (p = 0,017) und des tumorspezifischen Überlebens (p = 0,010). Dabei ist die Gruppe der Patienten mit überdurchschnittlich hoher Apoptoserate immer diejenige mit der günstigeren Prognose.
