Analysis of the expression of Wolf-Hirschhorn-Candidate-1 (WHSC1) in the adult murine brain
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WHSC1 is a potential causative gene for Wolf-Hirschhorn syndrome, a syndrome associated with mental disability. The function and regulation of WHSC1 in the adult brain are largely unknown. The following study is examining the expression pattern of WHSC1 in the adult murine brain to gain insight into possible functional implications. Immunofluorescence staining of tissue sections from the brain of adult mice was performed. The staining was performed with antibodies against WHSC1 as well as specific markers for different cell populations. Pictures taken with confocal microscopy were used for evaluation. The overall expression of WHSC1 was examined throughout the whole brain and in more detail in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. qPCR analysis was performed to assess the expression of WHSC1 in neurospheres with a conditional Sox4/Sox11 knock-out. Comparison was made between the WHSC1 expression in samples with and without the induction of the knock-out. The Immunofluorescence stainings showed a widespread expression of WHSC1 throughout the whole brain. Between the examined cells the intensity of the immunofluorescence was varying significantly. A higher immunofluorescence correlates with a higher expression of WHSC1 in these cells. This elevated signal occurs more in certain brain parts and cell populations. One of the brain regions with an especially high number of highly WHSC1 expressing cells is the subgranular zone (SGZ) of the DG inside the hippocampal formation. This region is known for adult neurogenesis. Adult neurogenesis is the process of the generation of new neurons from stem cells in the adult brain. It can only be found in a few brain areas. These are the SGZ and the subventricular zone (SVZ). Also, in the SVZ a remarkable amount of WHSC1 strongly positive cells was found. This implicates a possible role of WHSC1 during the different stages of adult neurogenesis. Therefore, analysis of the expression of WHSC1 during the different stages of neurogenesis in the DG was performed. This was achieved by coimmunostaining WHSC1 with stage specific markers of adult neurogenesis. A higher expression of WHSC1 war observed in specific stages of differentiation. This might hint to a role of WHSC1 during adult neurogenesis. Therefore, the effect of SOX11 on the expression of WHSC1 was examined. SOX11 is a transcription factor known to regulate adult neurogenesis. Prior to this study WHSC1 was found as a possible downstream target of SoxC transcription factors in a transcriptomic analysis. (Steib, 2013) The expression of WHSC1 was compared between cells with a SOX11/SOX4 conditional knock-out with and without induction of the knock-out by performing qPCR. The results were ambivalent, possibly resulting from the low sample number. Also, the effect of SOX4/SOX11 knock-out on WHSC1 expression was observed in individual cells in the DG by immunofluorescence staining. In the cells with the SOX4/SOX11 knock out the WHSC1 expression was lower than in the control. Lastly the intensity of the WHSC1 immunoreactivity in the area of the DG was measured in SOX11 gain of function, compared to normal SOX11 levels. A slight increase in WHSC1 immunoreactivity was observed, which might hint to an upregulation of WHSC1 expression caused by higher SoxC expression. Nevertheless, further studies with a higher sample size will be needed to give a definitive assertion about the effect of SoxC transcription factors on the expression of WHSC1. In summary, this study is showing a WHSC1 expression pattern with a low intensity in many brain areas, but high variability in the intensity between individual cells. Prominent expression was observed in regions of adult neurogenesis. It was shown, that WHSC1 is expressed higher in specific stages of adult neurogenesis. This transient upregulation could hint at a role of WHSC1 in the regulation of adult neurogenesis. This process may be regulated by SoxC transcription factors. A possible correlation of WHSC1 and SoxC transcription factors was shown. Further studies about the role of WHSC1 in neuronal precursor cells in adult neurogenesis, as well as the regulation of WHSC1 expression are needed to complement these results.
Abstract
WHSC1 ist ein potentiell verursachendes Gen für die mit einer neurologischen Entwicklungsstörung einhergehende Erkrankung Wolf-Hirschhorn-Syndrom. Die Funktion und Regulation von WHSC1 im adulten Gehirn sind zu großen Teilen unbekannt. Die nachfolgende Arbeit untersucht das Expressionsmuster von WHSC1 im Gehirn adulter Mäuse um daraus Schlüsse auf mögliche Funktionen von WHSC1 zu ziehen. Es wurden Immunfluoreszenzfärbungen von Gewebeschnitten des Gehirns adulter Mäuse durchgeführt. Dabei erfolgte die Färbung mit Antikörpern gegen WHSC1, sowie gegen spezifische Marker für verschiedene cerebrale Zellpopulationen. Zur Auswertung wurden Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop erstellt. Dabei erfolgte die Evaluation der Expression von WHSC1 im gesamten Gehirn, sowie im Detail im Gyrus dentatus (DG) des Hippocampus. Zudem wurde eine qPCR Analyse der Expression von WHSC1 durchgeführt. Hierbei erfolgte die Untersuchung von Neurosphären mit einem konditionalen Sox4/Sox11 knock-out. Es wurde die Expression von WHSC1 in Proben mit bzw.ohne Induktion des knock-outs verglichen. In den Immunfluoreszenzfärbungen zeigte sich eine breit gestreute Expression von WHSC1 über das gesamte Gehirn hinweg. Es konnten jedoch deutliche Unterschiede in der Intensität der Fluoreszenz zwischen den untersuchten Zellen festgestellt werden. Eine vermehrte Intensität der Fluoreszenz weißt auf eine stärkere Expression von WHSC1 in diesen Zellen hin. Dieses erhöte Signal zeigt sich zudem in bestimmten lokalen Zellpopulationen signifikant vermehrt. Eine der Regionen mit auffallend hoher Dichte besonders stark WHSC1 exprimierender Zellen ist die subgranuläre Zone (SGZ) des DG im Hippocampus. Diese Region ist bekannt für die dort stattfindende adulte Neurogenese. Adulte Neurogenese ist der Prozess der Entstehung neuer Neurone aus Stammzellen im Gehirn des Erwachsenen. Adulte Neurogenese ist nur in wenigen begrenzten Regionen des erwachsenen Gehirns zu finden. Neben der SGZ ist dies die subventrikuläre Zone (SVZ). Auch hier konnten auffallend viele stark WHSC1 exprimierende Zellen gefunden werden. Dies impliziert eine mögliche Rolle von WHSC1 im Prozess der adulten Neurogenese. Es folgte daher die Untersuchung der Expression von WHSC1 in verschiedenen Stadien der Neurogenese im Bereich des DG. Dies wurde durch eine gleichzeitige Immunfluoreszenzfärbung von WHSC1 und Markern durchgeführt, welche für das Differenzierungsstadium der neu enstehenden Neuronen spezifisch sind. Hierbei zeigte sich eine stärkere Expression von WHSC1 in bestimmten Phasen der Differenzierung. Dies kann auf eine Rolle von WHSC1 in der Regulation der adulten Neurogenese hinweisen. Es wurde daher der Einfluss von SOX11, einem Transkriptionsfaktor, mit bekanntem Einfluss auf die Regulation der adulten Neurognese, auf die Expression von WHSC1 untersucht. Im Vorfeld waren zudem bei einer Studie zu SoxC Transciptionsfaktoren, Hinweise auf WHSC1 als mögliches nachgelagertes Ziel aufgefallen (Steib, 2013). Es erfolgte daher in der hier vorliegenden Studie die Analyse der WHSC1 Expression durch qPCR unter konditionalem SOX11/SOX4 knock out im Vergleich zu nicht manipulierten SOX4/SOX11 Expressionsleveln. Hierbei ergaben sich uneindeutige Ergebnisse, welche auch durch die nur geringe Probenanzahl bedingt sein können. Zudem wurde der Einfluss eines SOX4/SOX11 knock-outs auf die WHSC1 Expression in einzelnen Zellen des DG durch Immunfluoreszenzfärbung betrachtet. In den Zellen mit SOX4/SOX11 knock-out zeigte sich eine verminderte WHSC1 Expression im Vergleich zur Kontrolle. Zuletzt wurde die Intensität der WHSC1 Immunreaktivität im Bereich des DG nach SOX11 Überexpression mit der WHSC1 Immunreaktivität unter Kontrollbedingungen gemessen. Hier ergab sich eine leichte Erhöung des WHSC1 Immunfluoreszenzsignals. Dies könnte auf eine Hochregulierung der WHSC1 Expression in Folge der vermehrten SoxC Expression hinweisen. Es werden jedoch weitere Studien mit größeren Probenzahlen notwendig sein um eine endgültge Aussage über den Einfluss einer verminderten SoxC Expression auf die Expressinoslevel von WHSC1 zu treffen. Zusammenfassend zeigt die hier vorliegende Studie ein WHSC1 Expressionsmuster mit einer Expression auf einem niedrigen Niveau in vielen Bereichen des Gehirns, jedoch einer großen Variabiliät in der Ausprägung der Expression zwischen verschiedenen Zellen. Hierbei ergab sich eine Betonung der Regionen in welchen auch adulte Neurogenese stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass WHSC1 in bestimmten Stadien der adulten Neurogenese vermehrt expremiert wird. Diese transiente Erhöhung kann auf eine Rolle von WHSC1 in der Regulierung der adulten Neurogenese hinweisen. Diese Regulierung könnte über die Regulation von WHSC1 durch SoxC Transkriptionsfaktoren gesteuert werden. Es zeigte sich ein möglicher Zusammenhang zwischen SoxC und WHSC1 Expressionsleveln. Weitere Studien zur Rolle von WHSC1 in neuronalen Vorläuferzellen der adulten Neurogenese, sowie der Regulation der WHSC1 Expression werden notwendig sein um diese Erkenntnisse zu ergänzen.