Entwicklung eines schnellen, phänotypischen HIV-1 Resistenztests

Abstract

Nach wie vor stellen Medikamentenresistenzen ein Problem für HIV-Therapien dar. Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines schnellen phänotypischen Resistenztests, welcher ohne Infektionsrisiken eine Bewertung der Suszeptibilität des HI-Virus aus Patienten gegenüber antiretroviralen Medikamenten ermöglicht. Mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems konnte die direkte hemmende Wirkung von antiretroviralen Medikamenten auf die viralen Enzyme Protease (PR) und Reverse Transkriptase (RT) in transient transfizierten Zellen bestimmt werden. Hierzu wurde die virale RNA des HI-Virus aus Patientenplasma isoliert und revers transkribiert, um anschließend die für die Enzyme Protease und Reverse Transkriptase codierenden Abschnitte via PCR zu amplifizieren und in ein Verpackungsplasmid zu integrieren. Dieses Verpackungsplasmid ermöglichte die Expression von gag und einer rekombinanten Polymerase, welche die Protease und die Reverse Transkriptase beinhaltete. Durch eine anschließende transiente Co-Transfektion von 293T-Zellen mit dem Verpackungsplasmid und weiteren Plasmiden wurden pseudotypisierte lentivirale Partikel hergestellt, welche die rekombinante Polymerase beinhalteten und das Luciferase-Reportergen übertrugen. Die erfolgreiche Expression der Luciferase durch die lentiviralen Partikel ist von einem Replikationszyklus abhängig, welcher die Aktivität der PR und der RT benötigt. Daher indiziert eine Erniedrigung des Luciferase-Signals bei steigenden Konzentrationen von antiretroviralen Medikamenten, welche die Aktivität der PR und RT inhibieren, die Suszeptibilität der Enzyme auf die jeweiligen Medikamente. Mit dem phänotypischen Assay konnte das Ansprechen der viralen Enzyme PR und RT von HI-Viren aus Patientenserum auf antiretrovirale Medikamente in vitro untersucht werden, was eine künftige Anpassung einer antiretroviralen Behandlung ermöglicht. Ein Vergleich zwischen genotypischen Daten, welche mit einigen Online-Tools gewonnen wurden, dem virusbasierten phänotypischen Assay, welcher in der Diagnostik des Instituts für Molekulare Virologie Erlangen eingesetzt worden war und dem neuen, vektorbasierten Test zeigt kongruente Ergebnisse. In Anbetracht der Dauer und möglichen Infektiosität anderer phänotypischer Assays, kann der neu entwickelte Assay eine Alternative für den regulären Gebrauch in diagnostischen Laboren darstellen. Für die Implementierung des Assays sind weitere Durchführungen und Validierungen notwendig. Show more