Abstract Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) originates in the nasal cavities, paranasal sinuses, oral cavity, nasopharynx, oropharynx, hypopharynx and larynx. HNSCC is the sixth most common aggressive malignancy in the world. (https://cancerci.biomedcentral.com/articles, 2018). Although numerous therapeutic options, including surgery, radiotherapy, chemotherapy as well as immunotherapy, have been used in clinical practice for decades, the prognosis of HNSCC patients remains unsatisfactory. In recent years, the role of the complex mechanism of interaction between tumors and immune cells in the tumor microenvironment (TME), in tumor progression has been intensively researched. It is now accepted that local inflammatory processes can contribute to the development of malignant tumors and influence the course of cancer (G. Niedobitek, https://link.springer.com, 2015). For a long time, attention in this regard was focused on lymphocytes, especially T cells. In recent years, a whole series of experimental and clinical studies have suggested that tumor-associated macrophages (TAMS) could play a central role in the progression of tumors. Moreover, tumor-associated macrophages (TAMs) account for approximately 50% of solid tumors (Pisani, 2020), making them among the most abundant cells in the microenvironment of tumors. Moreover, TAMs are divided into M1-polarised macrophages and M2-polarised macrophages (alternatively activated macrophages). M1-polarised macrophages also known as M1-like type (pro� inflammatory) are thought to have antineoplastic effects, meanwhile M2-polarised macrophages (M2- like type) (immunosuppressive and cancer-promoting) can support tumor growth at different levels (Sica A, 2012). There is sufficient evidence that TAMs play a crucial role in controlling malignancy. However, the communication mechanisms between M2 tumor-associated macrophage and cancer cells in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) are still largely unknown. Hence understanding the dynamics of the immune microenvironment is crucial for the development of immune-based strategies in the treatment of head and neck squamous cell carcinoma. Several studies have investigated whether TAMs markers, namely CD68+ and CD163+ TAMs, could serve as prognostic factors in patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). In a study of head and neck tumors, the expression of CD163+ TAMs in HNSCC was found to be unfavorable for clinical outcome after definitive RCT (P Balermpas, 2014). (Giuseppe Troiano V. C., 2019) reviewed immunohistochemical studies on HNSCC and showed that the pan-macrophage indicator CD68 has no prognostic value, whereas the M2-type indicator CD163 predicts poor prognosis. (Ayan Tyagi Kumar A. K., 2019) found that increased CD68+ and CD163+ density was associated with poor clinicopathological indicators and outcomes (advanced T stage, nodal metastasis, higher rate of vascular invasion, higher rate of lymphatic invasion and poor tumor differentiation). The aim of this study was to further define the prognostic significance of tumor-associated macrophages populations in HNSCC, by analyzing the effect of the overall-density of CD68+ and CD163+ tumor-associated macrophages on the prognosis and overall-survival (OS) of patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. The analysis in this work consisted of two patient collectives with squamous-cell� carcinoma of the head and neck from the University Hospital Erlangen/Germany. The first collective included patients with HNSCC from the study of Mariana Tabachnyk (MT patient collective) (Tabachnyk, 2012). The second patient collective included Patients from the research conducted by Cécile Barth and Silke Schmidt-Heck (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013). - All 3, former PhD students at the Radiation Clinic of the University Hospital Erlangen/Germany. Futher, histopathological examination of the tumor and lymph node resection samples from both patient collectives were conducted. After evaluation of the Tissue-Microarrays (patient samples) from both patient collectives [MT (patient collective = 3) n=86 patients and CeSi (patient collective = 4) n=151 patients, Total n=237 patients] relevant observations could be made; regarding the correlation between the cell density of CD68+ and CD163+ tumor-associated macrophages in the tumor (epithelium) as well as in the peritumoral stroma, (including other available/relevant patient characteristics), with the overall-survival (OS), the recurrence-free survival (no evidence of disease� survival, NED) and the probability of metastasis development. Results and observations MT patient collective In the subgroup of patients from the MT patient collective with biopsy samples from control lymph nodes that contained high total cell density of CD163+ tumor-associated macrophages in the epithelium - a better relapse-free survival could be observed. Indeed, these patients had fewer recurrences of head and neck squamous cell carcinoma than patients of the same collective with lower total cell density of CD163+ tumor-associated macrophages in the epithelium of control lymph nodes (p-value = 0.02 NED). Further, younger patients (<52 years old) of this collective (MT) showed a better overall-survival (p� value = 0.045 OS) compared to patients of the same collective who were >52 years old at the time of diagnosis of the HNSCC. CeSi patient collective Patients of the CeSi collective with biopsy samples directly from the tumor center, which contained a high cell density of CD68+ tumor-associated macrophages in the epithelium, showed a significantly fewer occurrence of metastases (p-value= 0.017). Both patient collectives (MT and CeSi) Patients from both groups with no distant metastases or local recurrences of the squamous cell carcinoma of the head and neck had a much better overall survival than patients of these groups with distant metastases or local recurrences of the primary tumor (p-value < 0.001 metastasis status, p� value < 0.001 recurrence status). Conslusion Several studies have investigated whether tumor-associated macrophage-markers, namely CD68 and CD163 could serve as prognostic factors in patients with head and neck squamous cell carcinoma. In a study of head and neck tumors, the expression of CD163 in HNSCC was found to be unfavorable for clinical outcome after definitive RCT (P Balermpas, 2014). (Ayan Tyagi Kumar A. K., 2019) found that increased CD68+ as well as CD163+ density was associated with poor clinicopathologic indicators and outcomes; including advanced T-stage, nodal metastasis, higher rate of vascular invasion, higher rate of lymphatic invasion, as well as poor tumor differentiation. (Giuseppe Troiano V. C., 2019) found in their study on HNSCC that the pan-macrophage indicator CD68 has no prognostic value, whereas the M2-type indicator CD163 predicts poor prognosis. This work confirmed the results of other studies. CD163+ tumor-associated macrophages were a more significant prognostic factor than CD68+ tumor-associated macrophages in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck - in terms of overall survival, metastasis development, as well as recurrence rate. Statistical evaluation of the prognostic impact of total cell density of CD68+ and CD163+ tumor-associated macrophages in patients with HNSCC revealed statistically significant results upon analyzing both macrophage subpopulations. Hence, CD68+ as well as CD163+ tumor-associated macrophages, -similarly to other possible markers [including p16(HPV) (Christin Geissler, 2013)] of the head and neck squamous cell carcinoma, can be used to determine the prognosis of patients with head and neck squamous cell carcinoma. CD68+ and CD163+ tumor-associated macrophages thus have potential for future clinical use.

Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Plattenepithelkarzinome des Kopfes und des Halses (HNSCC) haben ihren Ursprung in den Nasenhöhlen, den Nasennebenhöhlen, der Mundhöhle, dem Nasopharynx, dem Oropharynx, dem Hypopharynx und dem Larynx. HNSCC ist die sechsthäufigste aggressive bösartige Erkrankung in der Welt (https://cancerci.biomedcentral.com/articles, 2018). Obwohl in der klinischen Praxis seit Jahrzehnten zahlreiche Therapiemöglichkeiten, u.a. Chirurgie, Strahlentherapie, Chemotherapie sowie Immuntherapie eingesetzt werden, ist die Prognose von HNSCC-Patienten nach wie vor unbefriedigend. In den letzten Jahren wurde die Rolle des komplexen Mechanismus der Interaktion zwischen Tumoren und Immunzellen in der Tumor-Mikroumgebung (TME) bei der Tumorprogression intensiv erforscht. Es ist inzwischen akzeptiert, dass lokale Entzündungsprozesse zur Entstehung bösartiger Tumoren beitragen und den Verlauf von Krebserkrankungen beeinflussen können (G. Niedobitek, https://link.springer.com, 2015). Dabei richtete sich die Aufmerksamkeit lange Zeit auf Lymphozyten, insbesondere auf T-Zellen. Eine ganze Reihe experimenteller und klinischer Studien hat in den letzten Jahren nahegelegt, dass tumorassoziierten Makrophagen (TAMS) eine zentrale Rolle bei der Progression von Tumoren zukommen könnte. Zudem machen tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) etwa 50 % der soliden Tumoren aus (Pisani, 2020), und gehören somit zu den am häufigsten vorkommenden Zellen der Mikroumgebung von Tumoren. Vereinfacht werden bei TAMs, M1- polarisierte Makrophagen und M2-polarisierte Makrophagen (alternativ aktivierte Makrophagen) unterschieden. M1-polarisierten Makrophagen auch M1-ähnlicher Typ (pro-inflammatorisch und daher krebshemmend) werden antineoplastische Effekte zugeschrieben, während M2-polarisierte Makrophagen (M2-ähnlicher Typ) (immunsuppressiv/krebsfördernd) das Tumorwachstum auf verschiedenen Ebenen unterstützen können (Sica A, 2012). Es gibt genügend Beweise dafür, dass TAMs eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle von Malignität spielen. Die Kommunikationsmechanismen zwischen M2-Tumor-assoziierten Makrophagen TAMs und Krebszellen in Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses (HNSCC) sind jedoch noch weitgehend unbekannt. In dieser Hinsicht ist das Verständnis der Dynamik der Tumormikroumgebung von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung immunbasierter Strategien bei der Therapie von Plattenepithelkarzinom des Kopfes und des Halses. Ferner wurden in mehreren Studien untersucht ob TAMs-Marker, nämlich CD68 und CD163, als prognostische Faktoren bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses (HNSCC) dienen können. Aktuelle Daten legen nahe, dass CD163-positive Tumormakrophagen die Population der tumorassoziierten Makrophagen dominieren (Ayan Tyagi Kumar A. K., 2019). Weiterhin konnte in einer Studie über Kopf-Hals-Tumoren die Expression von CD163 in HNSCC als ungünstig für das klinische Ergebnis nach definitiver RCT eingestuft werden (P. Balermpas, 2014). (Giuseppe Troiano V. C., 2019) überprüften immunhistochemische Studien zu HNSCC und zeigten, dass der pan-Makrophage Indikator CD68 keinen prognostischen Wert hat, wohingegen der M2-Typ� Indikator CD163 eine schlechte Prognose vorhersagt. (Ayan Tyagi Kumar A. K., 2019) fanden heraus, dass eine erhöhte CD68+- und CD163+-Dichte mit schlechten klinisch-pathologischen Indikatoren und Ergebnissen (fortgeschrittenes T-Stadium, nodale Metastasierung, höhere Rate an vaskulärer Invasion, höhere Rate an lymphatischer Invasion und schlechte Differenzierung des Tumors) zusammenhängt. Das Vorhandensein von TAMs in großer Zahl in der Mikroumgebung des Tumors kann daher als Indikator für eine schlechte Prognose angesehen werden (Alessandro Menna Alves, 2017). Ziel dieser Arbeit war es, die prognostische Bedeutung von TAMs-Populationen bei HNSCC näher zu definieren, indem die Auswirkung der Gesamtdichte M1-ähnlicher und M2-ähnlicher tumorassoziierter Makrophagen (CD68+ und CD163+ TAMs) auf das Überleben sowie auf die Prognose von Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses analysiert werden konnten. Mit dieser Arbeit konnten die Ergebnisse anderer Studien bestätigt werden. Mit dieser Arbeit konnten die Ergebnisse anderer Studien bestätigt werden. CD163+ tumorassoziierte Makrophagen waren ein bedeutenderer prognostischer Faktor als CD68+ tumorassoziierte Makrophagen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses - in Hinsicht auf das Gesamtüberleben, Metastasen� Entwicklung, sowie Entstehung von Rezidiven. Bei der statischen Evaluierung des prognostischen Einflusses der Gesamtzelldichte CD68+ und CD163+ tumorassoziierter Makrophagen bei Patienten mit HNSCC, traten bei der Analyse beider Makrophagen Subpopulationen statistische signifikante Ergebnisse in Erscheinung. Somit können CD68+ als auch CD163+ tumorassoziierte Makrophagen, - gleichsam andere mögliche Marker [u.a. p16(HPV) (Christin Geißler, 2013)] des Plattenepithelkarzinoms des Kopfes und Halses, zur Bestimmung der Prognose von Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses eingesetzt werden. CD68+ und CD163+ tumorassoziierte Makrophagen haben somit Potenzial für den zukünftigen klinischen Einsatz. Insgesamt setzte sich die Auswertung bei dieser Arbeit aus zwei Patienten-Kollektiven mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses aus dem Universitätsklinikum Erlangen zusammen. Ein Kollektiv von Patienten mit HNSCC aus der Studie von Mariana Tabachnyk (MT) (Tabachnyk, 2012); sowie ein zweites Patienten-Kollektiv, aus der Arbeit von Cécile Barth und Silke Schmidt-Heck (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) (CeSi). - Alle 3, ehemalige Doktorandinnen an der Strahlenklinik des Universitätsklinikum Erlangen. Ziel der Recherche am MT-Patienten-Kollektiv, war es die prognostische Rolle von Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) bei Patienten mit HNSCC im Anschluss an eine neaodjuvante Radiochemotherapie zu untersuchen. Es wurde hierbei die morphologische Verteilung der tumorinfiltrierenden Entzündungszellen sowie deren Einfluss auf die Prognose untersucht (Tabachnyk, 2012). In gleicher Hinsicht war zielte die Arbeit von (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf� Hals-Tumoren, 2013) (CeSi-Patienten-Kollektiv) darauf, die Dichte von zwei Untergruppen von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) (den regulatorischen T-Zellen (Treg) und den zytotoxischen T-Zellen (CD8+)) im Tumor und in der Tumorinfiltrationszone zu ermitteln, den räumlichen Abstand der einzelnen Lymphozyten zueinanderzu untersuchen, um demzufolge,zum einen; eine Aussage über das typische Infiltrationsmuster sowie die Interaktionen zwischen den einzelnen Zellen treffen zu können, und zum anderen; die Einflüsse letztere auf die Prognose von Patienten mit HNSCC zu bestimmen (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013). Insgesamt wurden bei der Arbeit mit dem MT-Patienten-Kollektiv 58 Patienten zwischen 1997 und 2005 mit Mundhöhlenkrebs aufgenommen, die im Universitätskrankenhaus Erlangen behandelt wurden. Die Therapie bestand aus einer neoadjuvanten simultanen RCT gefolgt von einer kurativen Operation. Die Verteilung der tumorinfiltrierenden Entzündungszellen vor und nach RCT wurden verglichen. Prätherapeutische Biopsieproben wurden verwendet, und mit den nach RCT resezierten Geweben verglichen. Die Anzahl und Verhältnis von CD68+ und CD163+ Makrophagen in intraepithelialer und stromaler Lage vor und nach der RCT konnten dabei getrennt analysiert werden, und ihr prognostischer Wert untersucht werden. Es stellte sich aus der immunhistochemischen Analyse der Expression von CD68+ (u.a. M1-ähnlicher) und CD163+ (M2-ähnlicher) Makrophagen in den genannten Kompartimenten, dass CD68+ Makrophagen im stromalen (peritumoralen) Kompartiment vorherrschten, während CD163+ Zellen häufiger im intraepithelialen Kompartiment gefunden werden konnte. (Tabachnyk, 2012) stellte weiterhin fest, dass die neoadjuvante Behandlung mit einem allgemeinen Rückgang der tumorinfiltrierenden Entzündungszellen in beiden Kompartimenten assoziiert war. Analog zum MT-Patienten-Kollektiv wurden in die Studie mit dem CeSi-Patienten-Kollektiv 118 Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren, die in den Jahren 2000 bis 2010 in der Strahlenklinik des Universitätsklinikum Erlangen behandelt wurden, einbezogen. 214 Proben wurden untersucht, 131 von der Primärtumorseite und 88 vom invasiven Rand. Wenn möglich, wurden von jeder Region und jedem Patienten drei Gewebemikroarrays gewonnen und mit Antikörpern gegen Treg- und zytotoxische T-Zellen (FoxP3 und CD8+) doppelt immunhistologisch angefärbt. (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) stellten fest, dass eine geringe Dichte von CD8+ im Tumor der Biopsie mit einer besseren Prognose verbunden war. Im Gegensatz dazu war eine niedrige Dichte von FoxP3 im Tumor der Biopsie mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Am invasiven Rand haben sich die Verhältnisse umkehrt (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013). Eine höhere Dichte von T-Zellen korrelierte mit einem besseren Ergebnis und eine niedrige Dichte mit einem schlechteren. Um die Aussagekraft zu erhöhen, quantifizierten (Barth & Schmidt� Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T� Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) ebenfalls die Abstände zwischen den Zellen. Diesen Ergebnissen zufolge ging ein größerer Abstand zwischen den Zellen mit einer besseren Prognose einher. Ein geringerer Abstand andererseits mit einem schlechteren Ergebnis in Verbindung gebracht werden konnte (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013). Zur weiteren Untersuchung des räumlichen Verhaltens der Zellen wurde die Verteilung beobachtet. Hier konnte festgestellt werden, dass der Abstand von einer FoxP3-Zelle zur nächsten FoxP3-Zelle im Verhältnis zur FoxP3-Dichte regelmäßig ist, ebenso wie der Abstand von einer FoxP3- Zelle zu einer anderen CD8+-Zelle im Verhältnis zur FoxP3-Dichte. Eine unregelmäßige Verteilung ermittelten (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) für den Abstand einer CD8+-Zelle zu einer FoxP3-Zelle im Verhältnis zur FoxP3-Dichte. Zusammenfassend ließ sich bei der Arbeit von (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) sagen, dass sowohl die Dichte als auch die Verteilung von FoxP3 und CD8+-T-Zellen eine prognostische Bedeutung bei Kopf- und Halskrebs haben. Methoden Meine Arbeit umfasste zwei Kohorten von Patienten, bei denen ein Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses am Universitätsklinikum Erlangen diagnostiziert wurde. Alle n=58 Patienten aus dem ersten Patientenkollektiv (MT-Patienten-Kollektiv) wurden nach folgenden Kriterien in die erwähnte Studie aufgenommen: Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle, Alter zwischen 18 und 75 Jahren, ausreichende hämatologische Funktion, Leberfunktion und Nierenfunktion sowie Fehlen von Fernmetastasen und von Zweittumor. Die Stadieneinteilung wurde hier gemäß der Union for International Cancer Control (UICC 2002) festgelegt (Tabachnyk, 2012). Analog hierzu wurden alle für die Recherche von (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) (CeSi� Patienten-Kollektiv) relevanten n=150 Patienten nach folgenden Voraussetzungen in die Studie durch (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) aufgenommen: Plattenepithelkarzinom des Oropharynx, des Hypopharynx, der Mundhöhle oder des Larynx, eine definitive Radio(chemo)therapie, oder eine abgeschlossene adjuvante Therapie, eine vorhandene Krankenakte mit nachvollziehbarer Dokumentation sowie das Vorliegen eines Tumorgewebeblocks. Weiterhin erfolgte bei beiden Patientenkollektiven eine histopathologische Untersuchung der Tumor� sowie Lymphknotenresektionsproben. Hierdurch konnte u.a. das Ansprechen des Tumors auf die neoadjuvante Therapie beurteilt werden. Vom MT-Patientenkollektiv waren Gewebe-Microarrays und Immunhistochemie Paraffin-eingebetteter Biopsieproben des Primärtumors von 38 Patienten verfügbar. Zudem erhielte (Tabachnyk, 2012) Resektionsproben von 42 Patienten aus dem zuvor markierten Tumorbetts sowie aus Kontrolllymphknoten (nicht befallenen Lymphknoten) im Anschluss an RCT. Von 7 Patienten konnten Proben metastasierter Lymphknoten gewonnen werden. Schließlich standen von 22 Patienten des MT-Kollektivs sowohl vor als auch nach der Radiochemotherapie Proben zur Verfügung. Analog hierzu untersuchten (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) insgesamt 214 Patienten-Proben, - hiervon stammen 131 vom Primärtumorbett und 88 vom invasiven Rand. Ferner, eine effiziente Analyse der Färbung mit CD68+ (CD163+) spezifischem Antikörper ermöglichte die Tissue-Microarray-(TMA-)Technik. Biopsieproben des Primärtumors, des resezierten Tumorbereichs sowie der regionalen Lymphknoten wurden (Tabachnyk, 2012)zu Gewebe-Mikroarrays verarbeitet. Pro Patient wurden vom MT-Patienten-Kollektiv zwischen 4 und 16 Zylinder entnommen, so dass sich aus diesem Patienten-Kollektiv insgesamt 516 Zylinder ergaben (Tabachnyk, 2012). Beim CeSi-Patienten-Kollektiv wurde pro Patient bis zu 6 Tissue-Microarray-Stanzen erstellt, - mit jeweils bis zu 3 Stanzen aus der Primärtumorregion (Tumorgewebe) und bis zu 3 aus dem Tumorinvasionsfront (Tumorinfiltrationszone). Zusammen ergaben sich hier 552 Zylinder (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013). Anschließend wurden die Tissue-Microarrays (TMAs) beider Patienten-Kollektive eingescannt. Die aufgenommenen Patienten-Tissue-Microarrays (MT n = 102, CeSi n = 117 Zylinder) aus beiden Studien wurden auf einen Computer übertragen, wo ich sie mit Hilfe des Bildanalyseprogramms ''Biomas� Count'' (Biomas, Erlangen) auswertete. Die Anzahl der tumorassoziierten Makrophagen innerhalb des Tumors und im peritumoralen Stroma (CD68+ sowie CD163+) wurde quantifiziert (Zellen/mm2), [u.a. in Relation zu 100 Tumorzellen berechnet (Labelling Index, Li)]. Die Auswertung erfolgte ohne Kenntnis der Patientendaten. Die in diesem Schritt entstandenen Daten wurden direkt in eine Excel-Tabelle geschrieben. Weiter, da bei einigen TMAs die Qualität der nicht immer ausreichend war, liegen nicht zu allen initial angefertigten Stanzen (MT n=516, CeSi n=552 Zylinder) Daten vor. Das Gesamtüberleben (Overall Survival/OS) sowie das sog. no evidence of disease-Survival (NED)(Komplette Remission/ CR)1

• vom Tag der Krankheits-Diagnose bis zum Datum der letzten Untersuchung (Follow-Up), bzw. des Todes, oder des ersten lokalen, nodalen oder fernen Rezidivs - konnten bei den Studien von (Tabachnyk, 2012) und (Barth & Schmidt-Heck, Prognostische Bedeutung der Dichte und des mittleren Abstandes zwischen regulatorischen T-Zellen und Killer-T-Zellen bei Kopf-Hals-Tumoren, 2013) statistisch abgeleitet werden. Anhand hier vorliegenden Ergebnisse in Form von Excel-Dateien erfolgte anschließend für jeden Patienten (sowohl aus dem MT- als auch aus dem CeSi-Patienten-Kollektiv) eine Auftrennung am Median. Als Cut-off-Wert wurde hier der Median verwendet. Dafür wurden beide Patienten-Kollektive in zwei Gruppen zum untersuchten Merkmal eingeteilt. Während Gruppe „0“ jeweils einen geringen Wert des untersuchten Merkmals aufwies, beinhaltete Gruppe „1“ jeweils einen hohen Wert. So erhielte man bspw. für den Merkmal CD68+ (oder CD163+) vor bzw. nach RCT jeweils im Epithel (und im Stroma) eine Patientengruppe mit wenigen und eine Gruppe mit mehr CD68+ (oder CD163+) TAMs. Schließlich berechnete ich für beide Patienten-Kollektive anhand der Kaplan-Meier� Methode die Überlebenswahrscheinlichkeiten sowie die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eine Metastase bzw. eines Rezidivs. Nach Vergleich - mittels des Log-Rank-Tests - der verschiedenen Patienten-Merkmale mit dem Gesamtüberleben, der rezidivfreien Zeit sowie der metastasenfreien Zeit konnte der jeweilige Signifikanzwert (p-Wert) ermittelt werden. Ergebnisse und Beobachtungen Nach Auswertung der Tissue-Microarrays (Patientenstanzen) beider Patienten-Kollektive auf relevante Ergebnisse [MT (Patienten-Kollektiv = 3) n=86 und CeSi (Patienten-Kollektiv = 4) n=151, Total n=237], konnten sowohl im Tumor (Epithel) als auch im peritumoralen Stroma hinsichtlich der Korrelation zwischen der Zelldichte CD68+ und CD163+ tumorassoziierter Makrophagen (sowie anderer zur Verfügung stehenden Patienten-Merkmale), mit dem Gesamtüberleben (Overall Survival, OS), dem rezidivfreien Überleben (sog. no evidence of disease-Survival, NED) sowie der Wahrscheinlichkeit der Metastasen-Entstehung relevante Beobachtungen gemacht werden. MT-Patienten-Kollektiv In der Untergruppe von Patienten des MT-Patienten-Kollektivs mit Biopsieproben von Kontroll� Lymphknoten mit höherer Zelldichte CD163+ tumorassoziierter Makrophagen im Epithel traten seltener Rezidive des Plattenepithelkarzinoms des Kopfes und Halses auf als Patienten des gleichen Kollektivs mit einer geringeren Gesamtzelldichte CD163+ tumorassoziierter Makrophagen im Epithel der Kontroll-Lymphknoten (p-Wert = 0,02 NED). Zudem hatten jüngere Patienten (<52 Jahre alt) dieses Kollektivs (MT) ein besseres Gesamtüberleben (p-Wert = 0,045 OS) im Vergleich zu Patienten des gleichen Kollektivs die bei Diagnosestellung vom HNSCC >52 Jahre alt waren. CeSi -Patienten-Kollektiv Bei Patienten des CeSi-Kollektivs mit Biopsieproben aus dem Tumor (Tumorzentral), die eine hohe Zelldichte CD68+ tumorassoziierter Makrophagen im Tumor (Epithel) aufwiesen, traten signifikant weniger Metastasen auf (p-Wert= 0,017). Beide Patienten-Kollektive (MT und CeSi) Patienten beider Kollektive, bei denen keine Fernmetastasen oder Lokalrezidive des Plattenepithelkarzinoms des Kopfes und des Halses auftraten, zeigten ein viel besseres Gesamtüberleben als Patienten dieser Kollektive mit aufgetretenen Fernmetastasen oder mit lokalen Rezidiven des Primärtumors (p-Wert < 0,001 Metastasen-Status, p-Wert < 0,001 Rezidiv-Status). Schlussfolgerungen In mehreren Studien wurden untersucht ob tumorassoziierte Makrophagen-Marker, nämlich CD68 und CD163, als prognostische Faktoren bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses dienen können. In einer Studie über Kopf-Hals-Tumore konnte die Expression von CD163 in HNSCC als ungünstig für das klinische Ergebnis nach definitiver RCT eingestuft werden (P. Balermpas, 2014). (Ayan Tyagi Kumar A. K., 2019) stellten fest, dass eine erhöhte CD68+- und CD163+-Dichte mit schlechten klinisch-pathologischen Indikatoren und Ergebnissen; u.a. fortgeschrittenes T-Stadium, nodale Metastasierung, höhere Rate an vaskulärer Invasion, höhere Rate an lymphatischer Invasion sowie schlechte Differenzierung des Tumor zusammenhängt). (Giuseppe Troiano V. C., 2019) zeigten in ihrer Studie zu HNSCC, dass der pan-Makrophage Indikator CD68 keinen prognostischen Wert hat, wohingegen der M2-Typ-Indikator CD163 eine schlechte Prognose vorhersagt. Mit dieser Arbeit konnten die Ergebnisse anderer Studien bestätigt werden. CD163+ tumorassoziierte Makrophagen waren ein bedeutenderer prognostischer Faktor als CD68+ tumorassoziierte Makrophagen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses - in Hinsicht auf das Gesamtüberleben, Metastasen-Entwicklung, sowie Entstehung von Rezidiven. Bei der statischen Evaluierung des prognostischen Einflusses der Gesamtzelldichte CD68+ und CD163+ tumorassoziierter Makrophagen bei Patienten mit HNSCC, traten bei der Analyse beider Makrophagen Subpopulationen statistische signifikante Ergebnisse in Erscheinung. Somit können CD68+ als auch CD163+ tumorassoziierte Makrophagen, - gleichsam andere mögliche Marker [u.a. p16(HPV) (Christin Geißler, 2013)] des Plattenepithelkarzinoms des Kopfes und Halses, zur Bestimmung der Prognose von Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses eingesetzt werden. CD68+ und CD163+ tumorassoziierte Makrophagen haben somit Potenzial für den zukünftigen klinischen Einsatz.