Characterization of human blood type-2 innate lymphoid cells in cystic fibrosis lung disease
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Abstract
Standing out from classical type-2 T helper cells by their rapid, antigen-independent activation, type-2 innate lymphoid cells (ILC2s) have emerged as key immunological orchestrators of pulmonary inflammation and fibrosis in the last decade. However, their functional involvement in cystic fibrosis (CF)-associated lung disease is still largely unknown, although this progressive, terminal fibro-inflammatory disorder is characterized by an often underappreciated type-2 inflammatory milieu as well. Thus, we investigated the functional relevance of human ILC2s in CF lung disease. In addition, the general role of circulating blood ILC2s has been scrutinized only insufficiently so far. Since, however, frequency and phenotype of blood ILC2s are known to be significantly altered in patients with local fibro-inflammatory diseases, we hypothesized the targeted homing of blood ILC2s to the inflamed lung tissue in CF patients to influence disease progression locally.
By the flow cytometric analysis of human blood samples, our data revealed a significantly decreased number of CCR6+ blood ILC2s in CF patients compared to control subjects, which significantly correlated with an advanced pulmonary disease severity. Together with the published finding of drastically increased levels of the CCR6 ligand CCL20 in CF airways, this implied a CCR6-driven lung homing pathway of blood ILC2s in CF, which was further supported by functional chemotaxis assays and a newly established humanized mouse model. In the latter, the pulmonary accumulation of patient-derived and ex vivo expanded blood ILC2s was visualized in the context of the inflamed lung tissue via light-sheet fluorescence microscopy. By the intranasal administration of recombinant human CCL20 in this model, CCL20 was identified as chemotactic stimulus for lung-directed ILC2 migration in vivo. Together with in vitro data, showing the suppression of the ILC2 transmigration towards a CCL20 gradient by a CCR6-blocking antibody, this could further affirm ILC2 lung homing in a CCR6-CCL20-dependent manner. Locally, blood-derived ILC2s triggered the pulmonary accumulation of neutrophils and eosinophils and directly promoted remodeling of the inflamed lung tissue by inducing collagen VI expression in vitro and in vivo. Using primary human lung fibroblasts, the additive effect of ILC2-derived IL-4 and IL-13 was determined as important mediator of this phenomenon. Likewise, increased collagen VI levels were detected in pulmonary fibroblasts derived from a CF patient compared to a control subject when reevaluating a published RNA sequencing dataset. Although ILC2s could be demonstrated to express the CFTR gene, which carries the disease-causing mutations in CF, ILC2s derived from CF patients proved to be functionally competent with regard to their general lung homing capacity and the release of effector cytokines. Our data thus suggest lung homing, blood-derived ILC2s as relevant disease drivers in CF lung disease.
Collectively, we identified circulating human blood ILC2s as cellular reservoir, enabling the adaption of local ILC2 pools on demand by the targeted homing of peripheral blood ILC2s. In CF, we propose the CCL20-driven recruitment of CCR6+ blood ILC2s to the inflamed lung tissue to trigger pulmonary inflammation and fibrosis, suggesting lung homing blood ILC2s and their local effector functions as innovative therapeutic targets for the treatment of the chronically inflamed lung in CF patients.
Abstract
Typ 2 angeborene lymphoide Zellen (ILC2s, engl. type-2 innate lymphoid cells) zeichnen sich durch ihre schnelle, Antigen-unabhängige Aktivierung aus und heben sich dadurch von klassischen Typ 2 T-Helferzellen ab. Im letzten Jahrzehnt konnte ihre zentrale Schlüsselrolle in der Regulierung entzündlicher und fibrotischer Erkrankungen, insbesondere der Lunge, eindrucksvoll beschrieben werden. Ihr funktioneller Einfluss auf den Krankheitsverlauf der zystischen Fibrose (CF, engl. cystic fibrosis) ist jedoch noch weitgehend ungeklärt, obwohl Patienten mit CF unter anderem auch an einer fortschreitenden und meist tödlich verlaufenden Lungenerkrankung leiden, die von entzündlichen und fibrotischen Umbauprozessen sowie einer oftmals wenig beachteten Typ 2 Immunantwort geprägt ist. Darauf basierend wurde in dieser Studie untersucht, ob ILC2s auch bei der chronischen Lungenerkrankung von CF Patienten eine Rolle spielen. Zudem ist die grundsätzliche Funktion von ILC2s im peripheren Blut bisher nur unzureichend analysiert worden. Da jedoch bekannt ist, dass sowohl der Anteil der im Blut zirkulierenden ILC2s als auch ihr Phänotyp in Patienten mit entzündlichen und fibrotischen Erkrankungen maßgeblich verändert sind, befasste sich diese Arbeit mit der Frage, ob ILC2s aus dem peripheren Blutstrom gezielt in das entzündete Lungengewebe von CF Patienten einwandern und so direkt Einfluss auf den lokalen Krankheitsverlauf nehmen können.
Mit Hilfe durchflusszytometrischer Analysen von humanen Blutzellen konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der CCR6+ ILC2s im peripheren Blut von CF Patienten verglichen mit gesunden Kontrollprobanden signifikant reduziert war und dass dies mit der Progression der Lungenerkrankung korrelierte. Zusammen mit den massiv erhöhten Spiegeln des CCR6 Liganden CCL20, die bereits in den Atemwegen von CF Patienten beschrieben wurden, könnte diese Beobachtung auf die CCR6-vermittelte Auswanderung der ILC2s aus dem Blutstrom in das entzündete Lungengewebe von CF Patienten hindeuten. Die funktionelle Bestätigung dessen erfolgte mittels Chemotaxis-Analysen sowie eines eigens etablierten humanisierten Mausmodells. Letzteres ermöglichte die Analyse der Akkumulation patienteneigener ILC2s direkt im entzündeten Lungengewebe. Dazu wurden humane ILC2s aus dem Blut isoliert, ex vivo expandiert und ihre Akkumulation in der entzündeten Lunge mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Mittels intranasaler Verabreichung von rekombinant hergestelltem humanem CCL20 in diesem Modellsystem konnte CCL20 in vivo als chemotaktischer Stimulus für die gezielte Einwanderung humaner ILC2s in die Lunge identifiziert werden. Zusammen mit in vitro Daten, welche die Hemmung der ILC2 Migration in Richtung eines CCL20 Gradienten durch einen CCR6 Block zeigten, erhärtete dies die Hypothese einer CCR6-CCL20-vermittelten Auswanderung von ILC2s aus dem Blut in die Lunge. In der entzündeten Lunge induzierten diese ursprünglich aus dem Blut stammenden ILC2s die Anreicherung neutrophiler und eosinophiler Granulozyten und trieben zudem direkt den Gewebsumbau voran. Dies äußerte sich in einer vermehrten Kollagen VI Expression sowohl in vivo als auch in vitro. Mit Hilfe primärer menschlicher Lungenfibroblasten konnte die additive Wirkung von IL-4 und IL-13, die beide von ILC2s sezerniert wurden, als Vermittler dieser Kollagen VI-induzierenden Wirkung bestimmt werden. In Übereinstimmung damit wurden bei der Neuauswertung eines bereits veröffentlichten RNA-Sequenzierungsdatensatzes auch in Lungenfibroblasten, die aus einem CF Patienten stammten, erhöhte Kollagen VI Spiegel im Vergleich zu Fibroblasten eines gesunden Kontrollprobanden gemessen. Obwohl wir zeigen konnten, dass auch ILC2s das CFTR Gen exprimieren, das die für CF ursächlichen Mutationen trägt, erwiesen sich ILC2s von CF Patienten im Hinblick auf ihre grundsätzliche Fähigkeit gezielt in die entzündete Lunge einzuwandern sowie Effektorzytokine auszuschütten als uneingeschränkt funktionsfähig. Unsere Daten deuten daher darauf hin, dass ILC2s, die aus dem peripheren Blutstrom gezielt in das entzündete Lungengewebe einwandern, maßgeblich die Lungenerkrankung in CF Patienten vorantreiben.
Zusammenfassend konnte diese Arbeit zeigen, dass humane ILC2s im Blut als zelluläres Revervoir dienen, das es erlaubt, gewebsständige ILC2 Populationen durch die gezielte Rekrutierung von zirkulierenden ILC2s an den akuten Bedarf anzupassen. Im Fall von CF konnte CCL20 als chemotaktischer Faktor identifiziert werden, der die pulmonale Anreicherung von CCR6+ ILC2s aus dem Blutstrom fördert, um so entzündliche wie auch fibrotische Prozesse in der Lunge anzustoßen. Die Einwanderung von ILC2s aus dem peripheren Blut sowie deren Effektorfunktionen könnten demnach als neue therapeutische Zielstrukturen dienen und so eine innovative Behandlungsmöglichkeit für die chronisch überschießenden Immunreaktionen in der Lunge von CF Patienten ermöglichen.