Expression und Funktion von AKAP6 in Hinblick auf Embryogenese und Pathologie
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Background and Objectives Research towards special features of the musculature opens the possibility for medicine to understand and treat numerous diseases. For example, it has recently been discovered that postnatal disintegration of the centrosome in human cardiomyocytes terminates its regenerative capabilities. Entangling the mechanism around it could significantly improve the possibilities of rehabilitation after a heart attack. The process of the decaying centrosome and the associated restructuring of the cell could also be demonstrated in skeletal muscle. Further research might lead to a better understanding and treatment of muscular diseases. The present study investigates different proteins involved in cell restructuring, such as AKAP6 (A-Kinase Anchoring Protein 6), in healthy and pathologic tissue, and its influence on muscle development.
Methods The influence of proteins on myogenesis was investigated using zebrafish. The mRNA of the fish was modified by splicing morpholinos to render it useless and compared with a control group. The two groups were examined for the expression of the proteins. The muscle was examined for defects by fluorescence microscopy. In addition, the fish embryos were observed for 5 days. In a mouse model the expression of the proteins in wild-type was compared with knock-out mice corresponding to the disease of desminopathy. For this purpose, frozen sections were evaluated by fluorescence microscopy. In addition, human placenta, which also forms a syncytium and is thus similar to skeletal muscle, was examined for the expression of the proteins. For this purpose, frozen sections of human placenta were evaluated by fluorescence microscopy.
Results In zebrafish AKAP6 mRNA is expressed during embryogenesis in a period from 12 hpf (hours post fertilization) to 28 hpf. Lack of functional mRNA during development leads to a curvature of the longitudinal axis in 76% and forms the so-called bent tail phenotype. Fluorescence microscopy reveals a change in the somite boundaries from a chevron shape to a U-shape. In addition, the wall of the somite boundary is riddled with holes. The orientation of the muscle fibers deviates from the norm. In morphants the orientation is not strictly axial but deviates laterally. Light microscopic observation revealed an altered swimming ability. The curved fish were found to only swim in small circles. In addition, 38% of the fish did not hatch from the chorionic membrane until 5 dpf (days post fertilization). No change in myogenin expression could be detected in the morphant, but an upregulation of PCM1 (Pericentriolar Material 1) in troponin-negative tissue around centered nuclei was detected. No altered expression of AKAP6 could be detected in the desminopathy. The placenta does not express AKAP6. In the syncytiotrophoblast, the associated proteins of the nuclear MTOC (microtubule organizing center) such as nesprin and pericentrin could not be detected either.
Conclusion The zebrafish is a suitable object for further research on AKAP6 and MTOC- associated proteins. The macroscopically and microscopically visible changes in the morphants indicate an essential function of AKAP6 during embryogenesis. The pathogenesis of desminopathy has no regulatory influence on the expression of AKAP6. MTOC-associated proteins are partially increased in expression. This suggests that microtubules respond to the absence of desmin. The syncytiotrophoblast of the placenta has neither a centrosomal nor a non-centrosomal MTOC (ncMTOC) and thus differs in its cell architecture from other syncytia such as skeletal muscle.
Abstract
Hintergrund und Ziele Die Erforschung der Eigenheiten der Muskulatur eröffnet der Medizin die Möglichkeit, zahlreiche Erkrankungen zu verstehen und zu behandeln. So wurde in jüngster Zeit festgestellt, dass erst durch den postnatalen Zerfall des Zentrosoms in humanen Kardiomyozyten die Regenerationsfähigkeit des Herzens verloren geht. Die Möglichkeiten der Rehabilitation nach einem Herzinfarkt könnten dadurch deutlich verbessert werden. Der Prozess des zerfallenden Zentrosoms und der damit verbundenen Umstrukturierung der Zelle konnte ebenfalls in der Skelettmuskulatur nachgewiesen werden. Eine tiefere Erforschung dieses Umstands hilft somit bei dem Verständnis und der Behandlung zahlreicher Muskelerkrankungen. Die vorliegende Arbeit untersucht verschiedene an der Umstrukturierung beteiligte Proteine wie etwa AKAP6 (A-Kinase verankerndes Protein 6) in gesundem und krankem Gewebe sowie dessen Einfluss auf die Muskelentwicklung.
Methoden Der Einfluss der Proteine auf die Myogenese wurde anhand des Zebrafisches untersucht. Den Fischen wurde die mRNA mithilfe von Splicing Morpholinos so verändert, dass sie funktionslos war, und mit einer Kontrollgruppe verglichen. Die beiden Gruppen wurden auf das Vorhandensein der Proteine und die Muskulatur wurde fluoreszensmikroskopisch auf Defekte untersucht. Darüber hinaus wurden die Fischembryonen fünf Tage beobachtet. Im Mausmodell wurde die Expression der Proteine im Wildtyp mit Knock-Out-Mäusen verglichen, die der Erkrankung der Desminopathie entsprechen. Dazu wurden Gefrierschnitte fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet. Zusätzlich wurde humane Plazenta auf die Expression der Proteine untersucht, die ebenfalls ein Synzytium ausbildet und somit der Skelettmuskulatur ähnelt.
Ergebnisse Im Fisch wird AKAP6 während der Embryogenese in einem Zeitraum von 12 hpf (Stunden nach Befruchtung) bis 28 hpf exprimiert. Fehlende funktionstüchtige mRNA führt in der Entwicklung in 76% zu einer Krümmung der Längsachse – dem sogenannten „bent tail phenotype“. Fluoreszensmikroskopisch ist eine Veränderung der Somitengrenzen von einer V-Form in eine U-Form sichtbar. Darüber hinaus ist die Wand der Somitengrenze löchrig. Die Ausrichtung der Muskelfasern weicht ebenfalls von der Norm ab. In Morphanten ist die Ausrichtung nicht streng axial, sondern weicht nach lateral ab. Bei der lichtmikroskopischen Beobachtung ließ sich eine veränderte Schwimmfähigkeit feststellen. Die gekrümmten Fische waren nur noch in der Lage in kleinen Kreisen zu schwimmen. Außerdem ließ sich bei 38% der Fische feststellen, dass sie bis zum fünften Tag nach Befruchtung nicht aus der Chorionhülle schlüpften. Es konnte keine Änderung der Myogeninexpression im Morphanten nachgewiesen werden. In der Desminopathie konnte keine veränderte Expression von AKAP6 festgestellt werden. In Troponin-negativen Bereichen um den Zellkern konnte eine erhöhte Expression von PCM1 (Perizentrioläres Material 1) detektiert werden. Die Plazenta exprimierte kein AKAP6. Im Synzytiotrophoblasten konnten auch die assoziierten Proteine des nukleären Mikrotubuli-organisierenden Zentrums (MTOC) wie Nesprin und Pericentrin nicht detektierten werden.
Schlussfolgerung Der Zebrafisch eignet sich zur weiteren Erforschung von AKAP6 und MTOC-assoziierter Proteine. Die makroskopisch und mikroskopisch sichtbaren Veränderungen der Morphanten weisen auf eine essenzielle Funktion von AKAP6 während der Embryogenese hin. Die Pathogenese der Desminopathie hat keinen regulierenden Einfluss auf die Expression von AKAP6. MTOC-assoziierte Proteine sind teils verstärkt exprimiert. Das legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Mikrotubuli auf das Fehlen von Desmin reagieren. Der Synzytiotrophoblast der Plazenta besitzt weder ein zentrosomales noch ein ncMTOC (nichtzentrosomales MTOC) und unterscheidet sich in seiner Zellarchitektur dadurch deutlich von anderen Synzytien wie der Skelettmuskulatur.