Abstract Background and objectives Rheumatoid Arthritis (RA) has a prevalence of approximately 1% and is a chronic, inflammatory, autoimmune disorder hallmarked by the aggressive destruction of cartilage and bone. Even though there are plenty of options to keep the disease under control, not all patients with RA respond well to the common therapy options. Therefore, alternative or complementary treatment options for these patients should be evaluated. Low-dose radiotherapy (LD-RT) is one treatment option that involves intermediated doses of ionizing radiation. Particularly, a single dose of 0.5Gy per fraction has been shown to ameliorate inflammation and positively impact on bone metabolism. The GREWIS and the GREWISalpha consortium, funded by the BMBF, have focused on analysing the anti-inflammatory modes of action and genetic risks of low and intermediate doses of radiation. Examinations within these projects, conducted in the Radiation Osteoimmunology group of the Translational Radiobiology at the Department of Radiation Oncology of the Universitätsklinikum Erlangen, in which this thesis was performed, revealed that LD-RT has anti-inflammatory effects in the human tumor necrosis factor-α transgenic (hTNF-α tg) mouse model of RA and further prevents bone destruction. It must be stressed that the observed effects of LD-RT were mainly present in the inflammatory setting and that doses up to 0.5Gy had no harmful effects in a healthy setting (wild type mice). This research uses the hTNF-α tg mouse model, in particular strand tg197. A modification of hTNF-α that leads to constitutive overexpression of TNF-α tg, which causes a form of polyarthritis similar to that seen in humans, is present in this model. So far, a fundamental analysis of the progression of inflammation within this mouse model, regardless of the therapeutic approach, has not been performed. However, it is necessary to gain deeper understanding of the inflammatory phenotype of hTNF-α transgenetic mice over time because it will allow researchers to analyze the mechanisms of LD-RT more specifically and responses towards radiation depend on the initial inflammatory state. Further, these studies may allow the identification of possible targets for therapeutics in dependence of the inflammatory course. Methods In this thesis phenotyping of hTNF-α transgenetic male and female animals from age groups ranging between from 4 to 14 weeks was performed to investigate the time course of the disease in detail. A comparison to healthy littermates was included to gain information on the differences between an inflamed and non-inflamed setting and additionally in dependence of age and sex. A detailed characterization of the development of inflammation and bone erosion, the immune cell composition, and the expression of inflammation and bone metabolism-regulating genes compared to their healthy littermates (C57Bl/6) was performed using tg197 hTNF-α tg mice. These analyses were performed by evaluating histological sections of mouse paws and tibia, which were provided in three different stains: hematoxylin and eosin (HE) stain, toluidine blue (TB) stain, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) stain. Furthermore, gene analysis was performed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and serum samples were analyzed by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results and observations Cell types such as immune cells, fibroblast-like synoviocytes (FLS), osteoclasts (Oc), and osteoblasts (Ob) play a crucial role in RA. It is already known that the inflammatory processes in the joint have a decisive influence on these cell types, but the extent and regulation over time within the mouse model have not yet been precisely described. A significant difference between the different age groups was found that demonstrates, that age is an important parameter in experimental design and conclusions. Additionally, sex-specific differences in cytokine expression and secretion, both in healthy C57Bl/6 and in inflammatory hTNF- tg mice, with particular attention to the progression over time, was found. Both sexes were evaluated separately to examine possible gender-related influences on the inflammatory process in more detail. This comparison showed some significant differences in gene expression of Osterix and alkaline phosphatase (Alp) between male and female mice. This finding emphasizes again the importance of using mice of the same sex across experiments to prevent sex acting as a confound within and across research studies. When considering the interplay between Ob and Oc, the importance of high Oc numbers for bone resorption in destructive arthritis was detected. The absence of Oc in healthy mouse paws completely prevented bone resorption. Furthermore, the low Ob numbers and activity found in the pathological mice suggest that the osteoclastic resorption present is unlikely to be compensated. Conclusions and discussion
Our results can inform future research and allow researchers to appropriately select the age of the mouse for RA research, as well as an understanding of the changes that occur in the mouse paws and bone marrow at specific time points within the first 14 weeks. In addition, the results suggest that measurements should be made locally in the area of inflammation because the values of bone marrow measurements were independent of those within the local inflammation. This especially plays a role in the evaluation of therapy outcomes and should be considered in further studies with this mouse model. The closer look at the development and maintenance of inflammation in this model system of RA offers a more detailed understanding of how a variety of therapies, such as LD-RT, impact on inflammation and bone metabolism in relation to the initial inflammatory state. In the future, this might result in a more personalized application of LD-RT or specialized medication for patients with RA.

Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist, mit einer Prävalenz von ca. 1%, eine relativ häufig auftretende, chronische, entzündliche Autoimmunerkrankung mit fortschreitender destruktiver Zerstörung der Gelenke und des Knochens. Obwohl es heutzutage viele Möglichkeiten gibt, die Krankheit zu kontrollieren, sprechen nicht alle Patienten gut auf die verfügbaren, gängigen Therapieoptionen an. Daher ist es essentiell, alternative Behandlungsstrategien für diese Patientengruppen zu finden. Eine Behandlungsoption ist die Niedrigdosis-Strahlentherapie (LD-RT), bei der intermediäre Dosen ionisierender Strahlung eingesetzt werden. Insbesondere eine Einzeldosis von 0,5 Gy pro Fraktion hat sich als entzündungshemmend erwiesen und wirkt sich positiv auf den Knochenstoffwechsel aus. In dem vom BMBF geförderten GREWIS- und GREWISalpha-Konsortium liegt der Forschungsschwerpunkt auf der Analyse der entzündungshemmenden Wirkungsweisen und auf den genetischen Risiken niedriger und mittlerer Strahlendosen. Untersuchungen im Rahmen dieser Projekte, die in der Arbeitsgruppe Strahlenosteoimmunologie der Translationalen Strahlenbiologie an der Klinik für Radioonkologie des Universitätsklinikums Erlangen durchgeführt wurden, in der auch diese Arbeit entstand, zeigten, dass LD-RT im humanen Tumornekrosefaktor-α-transgenen (hTNF-α tg) Mausmodell der RA entzündungs-hemmend wirkt und darüber hinaus die Knochendestruktion verhindert. Dabei waren die beobachteten Effekte von LD-RT hauptsächlich in der entzündlichen Umgebung vorhanden und Dosen bis zu 0,5Gy hatten in einer gesunden Umgebung (Wiltyp-Mäuse) keine schädlichen Auswirkungen. Für diese Untersuchungen wurde das hTNF-α tg-Mausmodell, insbesondere der Strang tg197, verwendet. Das Modell weist eine Modifikation von hTNF-α auf, welches 5x an randomisierten Stellen ins Genom inseriert wurde. Diese führt zu einer konstitutiven Überexpression von TNF-α tg, die eine Polyarthritis verursacht, welche der im menschlichen Patienten sehr ähnelt. Eine grundlegende Analyse der Entzündungsentwicklung innerhalb dieses Mausmodells, unabhängig vom therapeutischen Ansatz, wurde bisher noch nicht durchgeführt. Um jedoch die Mechanismen der LD-RT genauer zu analysieren, ist es von großer Bedeutung, tiefere Kenntnisse über den Entzündungsphänotyp der hTNF-α transgenen Mäuse zu gewinnen, insbesondere da die Reaktionen auf die Strahlung vom anfänglichen Entzündungszustand abhängen. Außerdem können diese Studien die Identifikation möglicher Angriffspunkte für Therapeutika in Abhängigkeit vom Entzündungsverlauf ermöglichen. Methoden Die Phänotypisierung von hTNF-α-transgenen männlichen und weiblichen Tieren in dieser Arbeit erfolgt im Alter von 4 bis 14 Wochen, um den zeitlichen Verlauf der Erkrankung im Detail zu untersuchen. Ein Vergleich mit gesunden Wurfgeschwistern gibt Aufschluss über die Unterschiede zwischen entzündetem und nicht-entzündetem Gewebe sowie die Möglichkeit alters- und geschlechtsspezifische Unterschiede besser herauszustellen Eine detaillierte Charakterisierung der tg197 hTNF-α tg-Mäuse wurde hinsichtlich der Entwicklung von Entzündung und Knochenerosion, aber auch der Immunzell-zusammensetzung sowie der Expression von Entzündungs- und Knochenstoffwechsel-regulierenden Genen, im Vergleich zu ihren gesunden Wurfgeschwistern (C57Bl/6), durchgeführt. Diese Analysen erfolgten mittels Auswertung von histologischen Schnitten der Mauspfoten und Tibien, welche in drei verschiedenen Färbungen vorlagen: Hämatoxylin- und Eosin- (hematoxylin and eosin HE) Färbung, Toluidinblau- (toluidine blue TB) Färbung, Tartrat-resistente saure Phosphatase- (tartrate-resistant acid phosphatase TRAP) Färbung. Des Weiteren wurden Genanalysen mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (quantitative polymerase chain reaction qPCR) durchgeführt und Serumproben mithilfe des enzymatischen Immunadsorptionsverfahren (enzyme linked immunosorbent assay ELISA) analysiert. Ergebnisse und Beobachtungen Zelltypen, wie zum Bespiel Immunzellen, Fibroblasten-ähnliche Synoviozyten (fibroblast-like synoviocytes, FLS), Osteoklasten (osteoclasts, Oc) sowie Osteoblasten (osteroblasts, Ob) spielen eine Entscheidende Rolle in der RA. Es ist bereits bekannt, dass die Entzündungsvorgänge im Gelenk einen entscheidenden Einfluss auf diese Zelltypen haben, jedoch sind Ausmaß und Regulation über die Zeit im Mausmodell noch nicht genau untersucht. In dieser Studie wurden signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Altersgruppen gefunden, welche zeigen, dass das Alter ein wichtiger Parameter bei der Versuchsplanung und -auswertung ist. Zusätzlich wurden geschlechtsspezifische Unterschiede in der Zytokinexpression und -sekretion, sowohl in gesunden C57Bl/6 als auch in entzündeten hTNF- tg-Mäusen, unter besonderer Berücksichtigung des zeitlichen Verlaufs, gefunden. Beide Geschlechter wurden getrennt ausgewertet, um mögliche geschlechtsspezifische Einflüsse auf den Entzündungsprozess genauer untersuchen zu können. Dieser Vergleich zeigte signifikante Unterschiede bezüglich der Genexpression von Osterix und Alkalinischer Phosphatase (Alp) zwischen männlichen und weiblichen Mäusen. Durch dieses Ergebnis wird noch einmal hervorgehoben, wie wichtig es ist, in allen Experimenten Mäuse des gleichen Geschlechts zu verwenden, um zu verhindern, dass das Geschlecht innerhalb und zwischen den Studien als Störfaktor wirkt. Bei der Betrachtung des Zusammenspiels zwischen Ob und Oc konnte nachgewiesen werden, wie bedeutend hohe Oc-Zahlen für den Knochenabbau bei destruktiver Arthritis sind, da das Fehlen von Oc in gesunden Mäusepfoten die Knochenresorption vollständig verhindert. Außerdem deuten niedrige Ob-Zahlen und -Aktivität darauf hin, dass die vorhandene osteoklastische Resorption wahrscheinlich nicht kompensiert werden kann.

Schlussfolgerungen und Diskussion Unsere Resultate geben die Möglichkeit, das Alter für die Erforschung der RA angemessen auszuwählen sowie ein Verständnis für die Veränderungen, die in den Mäusepfoten und im Knochenmark zu bestimmten Zeitpunkten, innerhalb der ersten 14 Wochen, auftreten. Außerdem legen die Ergebnisse nahe, Messungen lokal im Bereich der Entzündung durchzuführen, da die Werte der Knochenmarksmessungen unabhängig von denen innerhalb der lokalen Entzündung waren. Insbesondere bei der Auswertung von Therapieerfolgen spielen diese eine Rolle und sollten in weiteren Studien mit diesem Mausmodell berücksichtigt werden. Die genauere Betrachtung der Entwicklung und Aufrechterhaltung der Entzündung in diesem Modellsystem der RA wird ein detaillierteres Verständnis dafür bieten, wie sich eine Vielzahl von Therapien, wie LD-RT auf die Entzündung und den Knochenstoffwechsel im Verhältnis zum anfänglichen Entzündungszustand, auswirken. In der Zukunft könnte dies zu einer stärker personalisierten Anwendung von LD-RT oder spezialisierten Medikamenten für Patienten mit RA führen.