Endogen und heterolog exprimierte Protease-aktivierte Rezeptoren vom Typ 2 (PAR2) fördern die Aktivierung des TRPV4-Ionenkanals im Oozytenexpressionssystem
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Background and aims
TRPV4 (transient receptor potential vanilloid type 4) is a member of the family of TRP ion channels. It is a Ca2+-permeable non-selective cation channel which is widely expressed in body tissues and plays a role in numerous (patho-)physiological processes. There is good evidence that TRPV4 functionally interacts with protease-activated receptor type 2 (PAR2) and is stimulated by proteolytic activation of the receptor. This can be investigated in the oocyte expression system in which human PAR2 (hPAR2) and human TRPV4 can be expressed heterologously. It is an experimental challenge that Xenopus laevis oocytes express an endogenous PAR2-like receptor (Xenopus-PAR2). Like heterologously expressed hPAR2 this receptor is also activated by trypsin. This makes it difficult to distinguish between the effects of both receptors. The aim of this thesis was to establish experimental conditions that allow a differentiation between the effects of Xenopus-PAR2 and hPAR2 on TRPV4. For this purpose, electrophysiological measurements were performed to verify the functional expression of endogenous Xenopus-PAR2 and heterologously expressed hPAR2 and TRPV4. In this context the new TRPV4-inhibitor GSK2193874 was used to establish the identity of TRPV4-mediated whole-cell currents. Furthermore, experiments were performed to investigate whether two serine proteases, neutrophil elastase and prostate-specific antigen (PSA), can affect TRPV4 function by activating PAR2.
Methods
Human TRPV4 and hPAR2 were heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes by injecting corresponding cRNAs. Whole-cell currents were measured in oocytes using the two-electrode voltage clamp technique. TRPV4-mediated currents were activated by the specific TRPV4-agonist GSK1016790A and were inhibited by different TRPV4-inhibitors (ruthenium red, HC067047 and GSK2193874). A characteristic current response elicited by receptor activation and mediated by Ca2+-activated chloride currents served as evidence for the functional expression of Xenopus-PAR2 and hPAR2. To activate Xenopus-PAR2 and hPAR2 differentially, the concentrations and exposure times of trypsin were varied and two synthetic PAR2-agonists (2-Furoyl-LIGRLO-NH2 and 2-Furoyl-LIAHK-NH2) were used. Additional experiments were performed in which oocytes were pre-treated with neutrophil elastase and PSA.
Results and observations
In this thesis experimental conditions were established for a reliable heterologous expression of human TRPV4 and hPAR2 in Xenopus laevis oocytes. This was achieved by systematically varying the amount of injected cRNA, the incubation time and the composition of the incubation solution. This made it possible to perform coexpression experiments to study the functional interaction of TRPV4 and hPAR2. In oocytes injected with cRNA for TRPV4, characteristic TRPV4-currents could be elicited by applying the TRPV4-activator GSK1016790A. As expected, these currents were not detected in control oocytes. Activated TRPV4-currents were rapidly and effectively inhibited by the general TRP channel inhibitor ruthenium red. In contrast, the more specific TRPV4-inhibitors HC067047 and GSK2193874 had only a small inhibitory effect on activated TRPV4 currents. However, prior application of GSK2193874 prevented subsequent activation of TRPV4 currents by the TRPV4 activator GSK1016790A. This suggests that GSK2193874 mainly prevents activation of TRPV4 channels with little inhibitory effect on channels that are already active. In oocytes injected with cRNA for hPAR2 and also in control oocytes, application of trypsin could elicit a transient current response typical for a Ca2+-activated chloride current due to receptor-mediated intracellular Ca2+ mobilization. By testing different trypsin concentrations, it was shown that 0.1-0.2µg/ml trypsin caused a robust current response in oocytes expressing hPAR2 but not in control oocytes. This indicates that activation of Xenopus-PAR2 requires higher trypsin concentrations than activation of hPAR2 which makes it possible to distinguish between the functions of the two receptors in the oocyte system. Furthermore, it was demonstrated that the activating peptides 2-Furoyl-LIGRLO-NH2 and 2-Furoyl-LIAHK-NH2 both activated hPAR2 but not Xenopus-PAR2. This observation can also be used to distinguish between effects of hPAR2 and Xenopus-PAR2. In coexpression studies it could be confirmed that specific activation of heterologously expressed hPAR2 enhanced subsequent activation of TRPV4-currents by GSK1016790A. This so-called sensitization of TRPV4 can also be achieved by stimulating endogenous Xenopus-PAR2 with trypsin. The hypothesis that the serine proteases neutrophil elastase and PSA can stimulate TRPV4-currents via activation of PAR2 could not be confirmed in this thesis.
Conclusion
In this thesis it could be confirmed that the oocyte expression system is suitable for the functional expression of hPAR2 and TRPV4. Carefully selected experimental conditions allow the differentiation between the effects of endogenous Xenopus-PAR2 and heterologously expressed hPAR2 on TRPV4. This is an important prerequisite for future studies to elucidate the molecular mechanisms underlying hPAR2-mediated sensitization of TRPV4. To clarify the regulatory interaction of hPAR2 and TRPV4 is of pathophysiological interest because PAR2-mediated activation of TRPV4 may play a role in various disease processes with increased local protease activity.
Abstract
Hintergrund und Ziele
TRPV4 (Transient Receptor Potential Vanilloid 4) ist ein Mitglied der TRP-Ionenkanalfamilie. Der Ca2+-permeable nichtselektive Kationenkanal TRPV4 wird in etlichen Geweben des Körpers exprimiert und ist an einer Vielzahl (patho-) physiologischer Prozesse beteiligt. Es gibt gute Hinweise dafür, dass TRPV4 funktionell mit dem Protease-aktivierten Rezeptor vom Typ 2 (PAR2) interagiert und durch dessen proteolytische Aktivierung stimuliert wird. Dies lässt sich im Oozytenexpressionssystem untersuchen, in dem humaner PAR2 (hPAR2) und humaner TRPV4 heterolog exprimiert werden können. Eine experimentelle Herausforderung ist dabei, dass Xenopus laevis-Oozyten einen endogenen PAR2-ähnlichen Rezeptor (Xenopus-PAR2) exprimieren. Dieser wird wie heterolog exprimierter hPAR2 durch Trypsin aktiviert, was es schwierig macht, zwischen Effekten der beiden Rezeptoren zu unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war es, Versuchsbedingungen zu etablieren, die eine Differenzierung der Effekte von Xenopus-PAR2 und hPAR2 auf TRPV4 ermöglichen. Dazu wurden elektrophysiologische Untersuchungen zum Nachweis der funktionellen Expression von endogenem Xenopus-PAR2 und von heterolog exprimiertem hPAR2 sowie TRPV4 durchgeführt. Dabei wurde unter anderem der neue TRPV4-Inhibitor GSK2193874 zum Nachweis von TRPV4-Strömen verwendet. Zudem wurde untersucht, ob zwei Serinproteasen, die Neutrophilen-Elastase und das Prostata-spezifische Antigen (PSA), über eine Aktivierung von PAR2 die Funktion von TRPV4 beeinflussen können.
Methoden
Humaner TRPV4 und hPAR2 wurden durch Injektion entsprechender cRNAs heterolog in Xenopus laevis-Oozyten exprimiert. An den Oozyten wurden mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme Ganzzellstrommessungen durchgeführt. TRPV4-vermittelte Ströme wurden durch den spezifischen TRPV4-Agonisten GSK1016790A ausgelöst und mit verschiedenen TRPV4-Inhibitoren (Rutheniumrot, HC067047 und GSK2193874) gehemmt. Als Nachweis für die funktionelle Expression von Xenopus-PAR2 und hPAR2 diente eine durch Rezeptoraktivierung ausgelöste und durch Ca2+-aktivierte Chloridströme vermittelte charakteristische Stromantwort. Zur differentiellen Aktivierung von Xenopus-PAR2 und hPAR2 wurden verschiedene Trypsinkonzentrationen und -expositionszeiten sowie zwei synthetische PAR2-Agonisten (2-Furoyl-LIGRLO-NH2 und 2-Furoyl-LIAHK-NH2) verwendet. Außerdem wurden Experimente durchgeführt, bei denen die Oozyten mit Neutrophilen-Elastase oder PSA vorbehandelt wurden.
Ergebnisse und Beobachtungen
Durch systematische Variation der injizierten cRNA-Menge, der Inkubationszeiten und der verwendeten Inkubationslösung konnten in dieser Arbeit Versuchsbedingungen für eine zuverlässige heterologe Expression von humanem TRPV4 und hPAR2 in Xenopus laevis-Oozyten etabliert werden. Dies ermöglichte Koexpressionsstudien zur Untersuchung der funktionellen Interaktion von TRPV4 und hPAR2. In mit cRNA für TRPV4 injizierten Oozyten konnten durch den TRPV4-Aktivator GSK1016790A charakteristische TRPV4-Ströme ausgelöst werden, die in Kontrolloozyten erwartungsgemäß nicht nachweisbar waren. Die aktivierten TRPV4-Ströme wurden durch den generellen TRP-Kanalinhibitor Rutheniumrot rasch und effektiv gehemmt, während die spezifischeren TRPV4-Inhibitoren HC067047 und GSK2193874 nur einen geringen inhibitorischen Effekt auf die aktivierten Ströme hatten. Bei vorheriger Applikation verhinderte GSK2193874 allerdings die anschließende Stimulation von TRPV4-Strömen durch den Aktivator GSK1016790A. Dies spricht dafür, dass GSK2193874 vor allem die Aktivierung von TRPV4 verhindert - bei nur wenig ausgeprägter Wirkung auf bereits aktivierte Kanäle. Sowohl an mit cRNA für hPAR2 injizierten Oozyten als auch an Kontrolloozyten konnte durch Applikation von Trypsin eine transiente Stromantwort ausgelöst werden, wie sie typischerweise durch Ca2+-aktivierte Chloridströme bei einer Rezeptor-vermittelten intrazellulären Ca2+-Mobilisierung verursacht wird. Durch Austestung verschiedener Trypsinkonzentrationen konnte gezeigt werden, dass mit 0,1-0,2µg/ml Trypsin in hPAR2-exprimierenden Oozyten eine deutliche Stromantwort detektiert werden konnte, nicht aber in Kontrolloozyten. Die Befunde sprechen dafür, dass Xenopus-PAR2 höhere Trypsinkonzentrationen zur Aktivierung benötigt als hPAR2 und dies im Oozytensystem eine funktionelle Unterscheidung der Rezeptoren ermöglicht. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die aktivierenden Peptide 2-Furoyl-LIGRLO-NH2 und 2-Furoyl-LIAHK-NH2 nur hPAR2 aber nicht Xenopus-PAR2 aktivieren können, was ebenfalls genutzt werden kann, um Effekte von hPAR2 und Xenopus-PAR2 zu unterscheiden. In Koexpressionsstudien konnte bestätigt werden, dass eine gezielte Aktivierung von heterolog exprimiertem hPAR2 die anschließende Aktivierung von TRPV4-Strömen mit GSK1016790A verstärkt. Diese sogenannte Sensitivierung von TRPV4 kann auch durch eine Stimulation des Xenopus-PAR2 mit Trypsin erzielt werden. Nicht bestätigt werden konnte in der vorliegenden Arbeit die Hypothese, dass die Serinproteasen Neutrophilen-Elastase und PSA über eine PAR2-Aktivierung TRPV4-Ströme stimulieren können.
Praktische Schlussfolgerungen
In der vorliegenden Arbeit konnte bestätigt werden, dass das Oozytenexpressionssystem für die funktionelle Expression von hPAR2 und TRPV4 geeignet ist. Dabei ermöglichen entsprechend gewählte Versuchsbedingungen, zwischen Effekten des endogenen Xenopus-PAR2 und Effekten des heterolog exprimierten hPAR2 auf TRPV4 zu unterscheiden. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für zukünftige Untersuchungen der molekularen Mechanismen, die der hPAR2-vermittelten Sensitivierung von TRPV4 zugrunde liegen. Eine weitere Aufklärung der regulatorischen Interaktion von hPAR2 und TRPV4 ist von pathophysiologischem Interesse, da eine PAR2-vermittelte Aktivierung von TRPV4 bei verschiedenen Krankheitsprozessen mit lokal erhöhter Proteaseaktivität eine Rolle spielen könnte.