Spezifische Eigenschaften der anti-Neutrophilen zytoplasmatischen Antikörper bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und deren Nachweis durch einen neuartigen, durchflusszytometrischen Test basierend auf Neutrophil Extracelullar Traps
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Background: Anti-neutrophil-cytoplasmic antibodies (ANCA) are auto-antibodies directed against components of neutrophil granulocytes and may be found in various inflammatory conditions, like small-vessel vasculitis or ulcerative colitis (UC). Routine ANCA screening is performed on ethanol-fixed neutrophils using indirect immunofluorescence technique. Yet, how neutrophil granule proteins become available to immunologic presentation is a matter of debate. In recent years, various studies have shown that neutrophils are able to extrude their chromatin decorated with granular proteins as neutrophil extracelullar traps (NETs).
Aim: This thesis aimed to show that (I) ANCA immunoreactivity may be found on NETs and (II) NETs may serve as a useful tool in a novel approach for ANCA detection.
Methods: Sera from patients suffering from either ANCA-associated vasculitis (n = 10), UC (n = 30) or sera from patients without diagnosed ANCA-associated diseases (n = 20), respectively, were subjected to indirect immunofluorescence and a newly developed method to detect ANCA by flow cytometry employing microbead technology.
Results: ANCA-related immunofluorescence was readily detectable on ethanol-fixed NETs, establishing NETs as a structure carrying ANCA target antigens. Moreover, we observed that neutrophils form NETs in response to microbeads and stick to the surface of these beads. Using these NET-coated microbeads in flow cytometry, we were capable of reliably detecting p-ANCA, c-ANCA, and a-ANCA in tested patient sera. UC-related complex DNase-1-sensitive ANCA (NET-ANCA) antigens were also detected on NET-coated microbeads.
Conclusion: The results confirm that NETs carry ANCA target antigens and can be used as a substrate for ANCA detection using indirect immunofluorescence technique. Furthermore, NET-coated microbeads may be commercially developed as a novel tool for automated ANCA screening assays using flow cytometry.
Abstract
Hintergrund: Anti-Neutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) sind Autoantikörper, die sich gegen Bestandteile neutrophiler Granulozyten richten und an diversen entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise primären Vaskulitiden kleiner Gefäße oder der Colitis Ulcerosa (CU), beteiligt sind. In der klinischen Standarddiagnostik wird das ANCA-Screening mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz auf Ethanol-fixierten neutrophilen Granulozyten durchgeführt. Eine besondere Herausforderung stellt die Detektion der atypischen ANCA der CU dar, da hier wahrscheinlich eine Vielzahl diverser Antigene an unterschiedlichen intrazellulären Lokalisationen unter funktioneller Beteiligung von Chromatin eine Rolle spielt. Es steht zur Diskussion, auf welchem Weg die granulären Proteine der neutrophilen Granulozyten im Körper zur immunologischen Präsentation verfügbar werden. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien gezeigt, dass neutrophile Granulozyten in der Lage sind, mit granulären Proteinen bestücktes Chromatin als neutrophile extrazelluläre Fallen (Neutrophil Extracellular Traps/NETs) auszustoßen. Hierdurch könnten mögliche granuläre und nukleäre ANCA-Antigene im extrazellulären Raum dem Immunsystem präsentiert werden.
Ziele: Im Rahmen meiner Dissertation stellte ich die Hypothese auf, dass (I) ANCA-Immunoreaktivität auf NETs gefunden werden kann und (II) NETs als nützliches Hilfsmittel für eine neuartige Vorgehensweise in der ANCA-Diagnostik genutzt werden können.
Methoden: Die verwendeten Seren stammten von Patienten, die entweder an einer ANCA-assoziierten Vaskulitis (n=10) oder Colitis Ulcerosa (n=30) erkrankt waren, beziehungsweise Patientenseren, die mit keiner diagnostizierten ANCA-assoziierten Erkrankung in Zusammenhang standen (n=20). Diese Seren wurden mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz auf Ethanol-fixierten neutrophilen Granulozyten und NETs untersucht. Darüber hinaus wurde eine neu entwickelte, durchflusszytometrische ANCA-Nachweismethode entwickelt und eingesetzt, die auf der Verwendung von zuvor mit NETs beschichteten Microbeads basierte.
Ergebnisse und Beobachtungen: Auf Ethanol-fixierten NETs konnte eine spezifische ANCA-Bindung mit Hilfe von Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. NETs tragen somit Zielantigene der ANCA. Des Weiteren wurde beobachtet, dass neutrophile Granulozyten NETs als Reaktion auf den Kontakt mit Microbeads bildeten und diese NETs an der Oberfläche der Beads haften blieben. Indem diese mit NETS-beschichteten Microbeads im Durchflusszytometer verwendet wurden, gelang es, pANCA, cANCA und aANCA zuverlässig in den getesteten Patientensera nachzuweisen. Die Antigene von CU-assoziierten, komplexen, DNase-1-sensiblen ANCA (NET-ANCA) wurden ebenfalls auf mit NETs beschichteten Microbeads erfasst.
Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse der Arbeit bestätigen, dass NETs ANCA-Antigene tragen und als Substrat in der ANCA-Detektion durch indirekte Immunfluoreszenz eingesetzt werden können. Darüber hinaus könnten mit NETs beschichtete Microbeads als neu entwickeltes Hilfsmittel für eine durchflusszytometrische ANCA-Screening Technik zu einem neuartigen kommerziellen Routinetest weiterentwickelt werden.