Onkogene Effekte von CD19: Vergleichende Untersuchungen an CD19-Verlustvarianten im murinen Burkitt Lymphom
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Background: CD19 is constitutively expressed on B-Lymphocytes and is a central target antigen in modern immunotherapies for B-cell-neoplasia (1). These therapies with CD19 specific antibodies or effector cells can be limited by the loss of CD19 rendering target cells invisible. This mechanism is highly relevant: the rate of antigen-negative relapses after immunotherapy can be as high as 30% (2). This comprehension addresses the consequences of the loss of CD19 as an important regulator for B-cell-receptor-signals on the growth of lymphoma cells. Methods: To compare the effect of CD19, CD19-negative and CD19-positive Burkitt-like cell lines were established: we cultivated CD19-deficient, λ-myc-transgenic, murine cell lines. These cell lines were then reconstituted with human CD19 by retroviral transduction, which led to stable CD19-positive cell lines. These cells were placed into co-cultivation with the CD19-negative cells. Furthermore, the survival of the CD19-positive and CD19-negative cell lines was tested by withdrawal of serum and glucose. Results: After transduction, we observed an autoselection of CD19-positive lymphoma cells. In co-culture, this selection of CD19-positive lymphoma cells was observed in an even faster fashion. We analyzed cell proliferation (VPD, BrdU) as well as the apoptotic-activity (7AAD/Annexin) in co-culture. The results showed no difference between the CD19-positive and CD19-negative lymphoma cells neither in proliferation, nor in apoptotic-activity. Thus, our results disprove enhanced proliferation of CD19-positive lymphoma cells in co-culture. The possibility of intercellular transmission of CD19 was considered and co-culture experiments with transwell were conducted. The transwell assay showed no difference in comparison to control co-culture. The metabolic analysis showed a significantly higher survival rate of CD19-positive lymphoma cells under deprivation of serum in vitro. Discussion: The results of the transwell-assay do not disprove the hypothesis of a transmission of CD19 between lymphoma cells. This could explain the observation in co-culture and opens an interesting outlook: The transmission of CD19 via membrane-connections has not yet been described and would be of high relevance for modern immunotherapies.
Abstract
Hintergrund und Ziele: CD19 wird über alle Reifungsstufen der B-Lymphozyten konstant exprimiert und ist ein zentrales Antigen für Immuntherapien gegen B-Zell-Neoplasien (1). Diese Therapien mit Antikörpern oder spezifischen Effektorzellen werden unter anderem durch Resistenzen limitiert: Die Zellen verlieren das Ziel-Antigen und entziehen sich damit der spezifischen Therapie. Dies ist von hoher Relevanz, da die Rate an Antigen-negativen Rezidiven nach Immuntherapie bis zu 30% beträgt (2). Welche Auswirkung dieser Verlust von CD19 als Regulator von B-Zell-Rezeptor-Signalen auf das Wachstumsverhalten von Lymphomzellen hat, ist Gegenstand dieser Arbeit.
Methoden: Um die Effekte von humanem CD19 auf Lymphomzellen vergleichend zu beobachten, wurden CD19-negative und CD19-positive Burkitt-like Lymphomzelllinien erzeugt. Dafür erfolgte die Kultivierung CD19-defizienter, λ-myc-getriebener, muriner Zellinien. Diese wurden anschließend retroviral mit humanem CD19 transduziert. Die daraus hervorgegangenen CD19-positiven Zelllinien wurden mit den primären, CD19-defizienten Zelllinien in Ko-Kultur gebracht. Weiterhin wurden die unterschiedlichen Zelllinien auf Überleben unter Serum- und Glukoseentzug untersucht.
Ergebnisse und Beobachtungen: Nach Transduktion selektierten sich die CD19-positiven Lymphomzellen selbst. In Ko-Kultur ließ sich diese Autoselektion in noch kürzerer Zeit beobachten. Proliferationsanalysen (VPD, BrdU), sowie Apoptoseanalysen (7AAD/Annexin) erbrachten keinen Unterschied zwischen den CD19-positiven und CD19-negativen Zelllinien in Ko-Kultur. Folglich wurde ein Wachstumsvorteil für CD19-positive Lymphomzellen in Ko-Kultur ausgeschlossen. Es wurde die Möglichkeit der interzellulären Übertragung von CD19 erwogen und Ko-Kultur-Versuche mit Transwell durchgeführt. Diese zeigten keinen Unterschied zu Kontroll Ko-Kulturen. Die Stoffwechselanalysen zeigten ein signifikant besseres Überleben der CD19-positiven Lymphomzellen unter Serumentzug.
Schlussfolgerungen: Die Transwell-Versuche schlossen die Möglichkeit des interzellulären Austausches von CD19 in Ko-Kultur nicht aus. Dies könnte eine Erklärung für die Beobachtungen in Ko-Kultur sein und eröffnet damit einen interessanten Ausblick: Die Übertragung von CD19 über Membranbrücken wurde bis heute nicht beschrieben und wäre von großer Bedeutung für aktuelle immuntherapeutische Therapieansätze.