Charakterisierung eines neuen inhibitorischen Rezeptors auf B1 Lymphozyten mit Hilfe von Siglec-G-defizienten Mäusen
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Abstract
In this thesis a new inhibitory receptor of B1 cells was characterized. The expression pattern of Sigelc-G was unknown so far and we examined it by RT-PCR. Siglec-G is expressed in all phases of B cell development and shows an especially high expression in pre B cells and B1a cells. Siglec-G expression in T cells and other splenic cells could not be detected. The Siglec-G expression on protein level showed the same pattern: high expression of Siglec-G in B1a cells, a lower expression in B2 cells and no expression in T cells. To analyse the function of Siglec-G, a Siglec-G deficient mouse strain was successfully generated and tested for the mutation in the Siglec-G gene, the loss of Siglec-G mRNA and Protein. The phenotype of the Siglec-G deficient mice indicates a specific function of Siglec-G on B1 cells. The loss of Siglec-G caused a massive increase of B1 cell numbers in spleen as well as in peritoneal cavity. This change in cell numbers is accompanied by a strongly increased calcium signalling in Siglec-G-/- B1a cells. The Siglec-G deficient mice also showed an elevated number of natural IgM and auto-reactive IgM in serum. However, the gene-deficient mice did not develop an autoimmune disease. An increase in IgM positive plasma cell numbers was detected. Siglec-G deficient mice showed quite normal immune responses upon immunizations. A bone marrow transfer experiment proofed that the large B1 cell expansion is a cell intrinsic effect. Siglec-G deficient mice show already one week after birth a higher number of B1 cells than wild type control mice. In this experiment it was also shown that during development B1 cells can be found first in spleen and after that in the peritoneal cavity of mice. The increased number of B1 cells in Siglec-G deficient mice could not be explained by a stronger proliferation of these cells. The Siglec-G-/- B cells proliferated less after IgM stimuli than wild type B cells. Besides, Siglec-G B cells showed a lower turnover than wild type B cells in an in vivo BrdU experiment. In summary, we characterized Siglec-G as a new inhibitory receptor on B1 cells that is responsible for the size of B1 cell population and calcium signaling in B1 cells.
Abstract
In dieser Arbeit wurde ein neuer inhibitorischer Rezeptor von B1-Zellen charakterisiert: Siglec-G. Das Expressionsmuster von Siglec-G war zu Beginn der Arbeit noch weitgehend unbekannt. Deshalb wurde es mittels RT-PCR Technik untersucht. Es wurde festgestellt, dass Siglec-G in allen Stadien der B-Zellen exprimiert wird. Eine besonders große Menge an Siglec-G mRNA konnte in Prä-B-Zellen und B1a-Zellen nachgewiesen werden. In T-Zellen und sonstigen Zellen der Milz konnte bislang noch keine Siglec-G mRNA gefunden werden. Die Siglec-G-Expression auf Proteinebene zeigte das gleiche Muster: es wurde viel Siglec-G-Protein in B1a-Zellen, weniger in B2-Zellen und kein Protein in T-Zellen nachgewiesen. Um die Funktion von Siglec-G aufzuklären, wurde erfolgreich eine Siglec-G-defiziente Mauslinie generiert und die Mutation im Siglec-G-Gen, das Fehlen der Siglec-G-mRNA und des Siglec-G-Proteins nachgewiesen. Der Phänotyp der Siglec-G-defizienten Maus lässt Rückschlüsse auf eine spezifische Funktion von Siglec-G in B1-Zellen zu. Der Verlust von Siglec-G hatte zur Folge, dass die Zellzahl der B1-Zellen sowohl in der Milz als auch in der Bauchhöhle stark anstieg. Das ist vermutlich auf die erhöhte Calciumsignalleitung in Siglec-G-defizienten B1-Zellen zurückzuführen. Begleitet wurde der starke Anstieg der Zellzahlen und der Calciumsignalleitung von einem ebenfalls erhöhten Serumspiegel an natürlichem und autoreaktivem IgM. Die Mäuse entwickelten jedoch keine Autoimmunität. Eine Erhöhung der IgM-Plasmazellen konnte in der naiven Maus aber festgestellt werden. Siglec-G-defiziente Mäuse zeigten nach Immunisierung relativ normale Immunantworten. Ein Knochenmarkstransfer- Experiment bestätigte, dass dieser deutliche Phänotyp der B1-Zellen zellintrinsisch ist. Siglec-G-defiziente Mäuse zeigten schon in der ersten Lebenswoche größere B1-Zellzahlen als die wildtypischen Kontrollmäuse. Bei diesem Experiment konnte auch gezeigt werden, dass B1-Zellen prinzipiell in der Entwicklung von Mäusen zuerst in der Milz auftreten und erst danach in der Bauchhöhle zu finden sind. Die größere Zahl an B1-Zellen in der Siglec-G-/- Maus konnte nicht mit einer stärkeren Proliferation erklärt werden. Die Siglec-G-defizienten Zellen proliferierten schlechter als Wildtyp Zellen nach IgM Stimuli. Außerdem zeigten die B-Zellen in der Siglec-G-/- Maus einen niedrigeren „turnover“ als die in der Kontrollmaus, wie in einem BrdU- Fütterungsexperiment herausgefunden wurde. Abschließend kann festgestellt werden, dass mit Siglec-G ein neuer inhibitorischer Rezeptor auf B1-Zellen gefunden und charakterisiert wurde.