Untersuchungen zur genregulatorischen Aktivität evolutionär konservierter, nicht-kodierender Regionen im Sox10 Locus
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The Sox family of transcriptional regulators is characterised by essential functions in the development of several cell types, tissues and organs. Sox10 is expressed in the neural crest, its derivatives, as well as in oligodendrocytes of the central nervous system. It plays an important role in these tissues during determination and differentiation processes. Sox10 mutations are associated with severe neurocristopathies. In order to understand how Sox10 expression is regulated during development evolutionary conserved non-coding sequences were identified in the Sox10 genomic region. Seven regions exhibited a greater than 70% sequence identity over at least 100 bp between mammalian genomes and the chicken genome. In contrast none of these regions exhibited a significant degree of conservation in Xenopus laevis, Danio rerio or Fugu rubripes. Each of these regions was then studied for its gene regulatory activities in transgenic mouse models. By linking the corresponding mouse sequences to a lacZ marker gene under the control of a hsp68 minimal promoter, five of seven regulatory regions were found to direct marker gene expression to Sox10 expressing cell types and tissues. These enhancers mediate Sox10 expression in the developing inner ear, in oligodendrocytes, and in several neural crest derivatives including the peripheral nervous system and chromaffine cells of the adrenal gland. Interestingly, they exhibit overlapping spatiotemporal activities and share binding sites in gelshift experiments for similar combinations of transcription factors. Additional analyses on U1 as one of these enhancers showed that its regulatory activity in Sox10 deficient embryos is strongly reduced. Therefore Sox10 seems to play a role in maintaing its own expression by a positive autoregulatory feedback mechanism. The identification of Sox binding sites in U1 and mutation analyses argue that the effect of Sox10 on U1 activity is direct. The combined enhancer activities are sufficient to explain the essential characteristics of Sox10 expression in early development both quantitatively and qualitatively.
Abstract
Die Transkriptionsfaktorfamilie der Sox-Proteine ist durch grundlegende Funktionen in der Entwicklung verschiedener Zelltypen, Gewebe und Organe gekennzeichnet. So ist der Transkriptionsfaktor Sox10 in der Neuralleiste und deren Derivaten sowie in Oligodendrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert und ist in diesen Geweben entscheidend an Determinierungs- und Differenzierungsvorgängen beteiligt. Mutationen im Sox10-Gen verursachen schwere Neurocristopathien. Um zu verstehen, wie die Sox10-Genexpression während der Entwicklung reguliert wird, wurden im Rahmen dieser Arbeit evolutionär konservierte, nicht-kodierende Regionen im Sox10-Genlocus identifiziert. Insgesamt sieben Regionen wiesen eine Sequenzhomologie von mehr als 70% über mindestens 100 bp zwischen verschiedenen Säugergenomen und dem des Huhns auf. Keine dieser Regionen zeigte hingegen eine signifikante Sequenzkonservierung gegenüber Xenopus laevis, Danio rerio oder Fugu rubripes. Die genregulatorischen Aktivitäten der entsprechenden Sequenzen aus der Maus wurden anschließend in transgenen Mausmodellen analysiert. Fünf der sieben identifizierten Regionen führten zu einer Reportergenexpression in verschiedenen Sox10 exprimierenden Zelltypen und Geweben, wenn sie in einem Transgen einem Hsp68 Minimalpromotor und einem LacZ Reportergen vorgeschaltet sind. Sie vermitteln die Sox10 Genexpression im sich entwickelnden Innenohr, in Oligodendrozyten und in verschiedenen Neuralleistenderivaten, inklusive des peripheren Nervensystems und der chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks. Interessanterweise weisen die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen zeitlich und räumlich überlappende Aktivitäten auf. Sie werden zudem in Gelretardierungsexperimenten von ähnlichen Kombinationen von Transkriptionsfaktoren gebunden. Untersuchungen an U1 als einem dieser Enhancer zeigten darüberhinaus, dass seine Aktivität in Sox10 defizienten Embryonen stark vermindert ist. Damit trägt Sox10 über einen positiven, autoregulatorischen Rückkopplungsmechanismus zum Erhalt der eigenen Genexpression bei. Die Identifikation von Sox Bindestellen in diesem Enhancer und deren Mutationsanalysen deuten darauf hin, dass dieser Einfluss von Sox10 direkt ist. Die Summe aller nachgewiesenen Enhanceraktivitäten ist ausreichend, um die essentiellen Merkmale der Sox10 Expression während der frühen Embryogenese quantitativ und qualitativ wiederzugeben.