Gewinnung und Charakterisierung antiviraler Wirkstoffe aus aquatischen Mikroorganismen
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Within this project antiviral compounds from aquatic microorganisms were identified which are characterised by a high activity against human cytomegalovirus (HCMV). Because of increasing viral resistance against conventional virustatics and unwanted side effects there is a special demand for new antiviral agents. The identified compounds are anionic exopolysaccharides of the unicellular red microalga Porphyridium purpureum and of the cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis. EPS were isolated by a combination of filtration or dialysis and chromatography from culture supernatant of cell suspensions. IC50-values (50 % virus inhibitory concentration) of EPS against HCMV in the used in vitro assay are 100 µg/ml for P. purpureum and 4 µg/ml for A. platensis whereas no considerable cytotoxic effects in the used cell culture system were detected up to 5 mg/ml (CC50 > 5 mg/ml). An antiviral activity of the EPS from microalgae genus Porphyridium has already been known against herpes simplex virus 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2) as well as against varicella-zoster virus (VZV), but not against the beta-herpes viruses that form the focus of the present work. Additionally to HCMV, the EPS from P. purpureum, isolated within this project, are active against human herpes virus 6A (HHV-6A) and vaccinia virus (VV). Antiviral polysaccharides from Arthrospira have been described as aqueous extract from biomass, known as Ca-Spirulan. The new isolated extracellular polysaccharides from A. platensis are active against HCMV and additionally against HSV-1, HHV-6A, human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and vaccinia virus. Chlorinated alkylsulfates (CSL) of Ochromonas danica of the sulfolipid compound group were also identified to be active against HCMV. In contrast to EPS from P. purpureum and A. platensis, CSL exhibit a comparatively high cytotoxicity against the human cell line MRC-5 and therefore a low antiviral selectivity. Diverse pro- and eukaryotic organisms (bacteria, yeast, and fungus) are also inhibited in growth by chlorinated lipids of O. danica. An important characteristic of EPS from P. purpureum and A. platensis is the antiviral mode of action that indicates an inhibition of an early step of virus infection (adsorption and/or fusion). The compounds can therefore be distinguished from conventional therapeutics that mostly inhibit viral DNA-replication. In order to achieve a constant product quality and a high space-time yield, the productivity and the dependence of product quality from culture parameters, using the exemplary EPS of P. purpureum, were studied. As a result, the surface illumination has a high impact on space-time yield. Additionally, the product quality was constant over a wide range of culture conditions concerning EPS composition and bioactivity. Within a scale-up experiment, the EPS synthesis of P. purpureum could successfully be transferred from 1 l- to 25 l-scale maintaining the antiviral activity. Microalgae compounds were isolated on the basis of their structure characteristics using filtration, precipitation and/or chromatography. The compound structures were determined by physical-chemical analysis. In this way, an extensive structural characterisation of antiviral EPS from P. purpureum and A. platensis as well as chlorosulfolipids of O. danica could be realised. Because of the identified monomer composition and the molecular mass of EPS from A. platensis, they can be structurally distinguished from intracellular Ca-Spirulan. In particular, the difference is caused by a lack of uronic acids in the extracellular product. The extracellular anionic polysaccharides from A. platensis therefore are novel active compounds with an even higher activity in the used in vitro assay against HCMV than the synthetic virustatic agent Gancyclovir. Parts of the presented work were realized amongst others in cooperation with the group of Prof. Siegert, Medical Clinic II, Charité, Berlin, supported by Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen AiF (grant 13883 BG) and the group of Prof. Marschall, Institute for Clinical and Molecular Virology, University of Erlangen-Nürnberg.
Abstract
Im Rahmen dieser Arbeit wurden antivirale Wirkstoffe aus aquatischen Mikroorganismen identifiziert, die sich durch eine hohe Aktivität gegenüber dem humanen Cytomegalievirus (HCMV) auszeichnen. Aufgrund zunehmender viraler Resistenzen gegen herkömmliche Virustatika und unerwünschter Nebenwirkungen ist die Bereitstellung neuartiger Wirkstoffe von besonderer Relevanz. Bei den identifizierten Wirksubstanzen handelt es sich um anionische Exopolysaccharide (EPS) der einzelligen Rotalge Porphyridium purpureum sowie des Cyanobakteriums Arthrospira (Spirulina) platensis. Die EPS wurden jeweils durch eine Kombination von Filtration oder Dialyse sowie Chromatographie aus dem Kulturüberstand der Zellsuspensionen gewonnen. Die IC50-Werte (50 % virusinhibierende Konzentration) der EPS gegen HCMV betragen im verwendeten in vitro-Assay 100 µg/ml für P. purpureum sowie 4 µg/ml für A. platensis, wobei bis 5 mg/ml keine wesentlichen zytotoxischen Effekte im verwendeten Zellkultursystem beobachtet wurden (CC50 > 5 mg/ml). Eine antivirale Wirksamkeit von EPS der Algengattung Porphyridium war bereits gegen Herpes-simplex-Virus-1 und 2 (HSV-1 und HSV-2) sowie Varicella-Zoster-Virus (VZV) beschrieben, jedoch nicht gegen die im Fokus dieser Arbeit stehenden beta-Herpesviren. Die isolierten EPS aus P. purpureum sind neben HCMV auch gegen das humane Herpesvirus 6A (HHV-6A) und Vacciniavirus (VV) wirksam. Antivirale Polysaccharide aus A. platensis waren bisher nur als wässriges Isolat der Biomasse bekannt (Ca-Spirulan). Für die neuartigen Exopolysaccharide aus A. platensis wurden neben der Wirksamkeit gegen HCMV weitere Aktivitäten gegenüber HSV-1, HHV-6A, gegen das humane Immunodefizienzvirus-1 (HIV-1) sowie Vacciniavirus nachgewiesen. Aus der Stoffgruppe der Sulfolipide wurden chlorierte Alkylsulfate (CSL) aus Ochromonas danica mit einer antiviralen Aktivität gegen HCMV identifiziert. Im Gegensatz zu den EPS aus P. purpureum und A. platensis weisen die CSL eine vergleichsweise hohe Zytotoxizität gegen die humane Wirtszelllinie MRC-5 auf, so dass eine geringe antivirale Selektivität zu verzeichnen ist. Auch gegen verschiedene pro- und eukaryotische Organismen (Bakterien, Hefen, Pilz) konnte für die chlorierten Lipide aus O. danica eine wachstumsinhibierende Wirkung nachgewiesen werden. Ein entscheidendes Charakteristikum der EPS aus P. purpureum und A. platensis besteht im antiviralen Wirkmechanismus, der auf eine Inhibierung einer frühen Phase der Virusinfektion (Adsorption und/oder Fusion) hinweist. Die EPS unterscheiden sich somit von herkömmlichen Virustatika, die im Allgemeinen die virale DNA-Replikation blockieren. Um den Anforderungen an eine konstante Produktqualität nachzukommen und eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) zu erreichen, wurden Untersuchungen zur Produktivität und zum Einfluss von Kultivierungsarametern auf die Produktqualität am Beispiel der EPS aus P. purpureum durchgeführt. Aus den Untersuchungen ist zu schließen, dass die Oberflächenbestrahlungsstärke einen starken Einfluss auf die RZA besitzt, während die Produktqualität unter den gegebenen Versuchsbedingungen eine hohe Konstanz bezüglich der EPS-Zusammensetzung und der Bioaktivität aufweist. Im Rahmen einer Maßstabsvergrößerung konnte die EPS-Synthese von P. purpureum unter Erhalt der antiviralen Wirksamkeit aus dem 1 l- in den 25 l-Maßstab übertragen werden. Die Wirkstoffe wurden auf Basis ihrer Stoffeigenschaften mittels Filtration, Präzipitation und/ oder Chromatographie aufgereinigt. Im Anschluss erfolgte eine Wirkstoffcharakterisierung unter Verwendung physikalisch-chemischer Messmethoden. Diesbezüglich wurde eine weitgehende strukturelle Beschreibung der antiviralen EPS aus P. purpureum und A. platensis sowie der Chlorosulfolipide aus O. danica erzielt. Aufgrund des identifizierten Monomeraufbaus sowie der molaren Masse sind die EPS aus A. platensis strukturell vom intrazellulären Ca-Spirulan zu unterscheiden. Der Unterschied ist insbesondere im Fehlen von Uronsäuren im extrazellulären Produkt begründet. Bei den extrazellulären anionischen Polysacchariden aus A. platensis handelt es sich somit um neuartige Wirksubstanzen, deren in vitro Aktivität gegen HCMV sogar die des synthetischen Virustatikums Gancyclovir übertrifft. Teile der vorliegenden Arbeit wurden unter anderem in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Siegert der Medizinischen Klinik II mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie, Charité, Berlin, im Rahmen des AiF-Forschungsvorhabens 13883 BG sowie der Arbeitsgruppe von Prof. Marschall, Institut für Klinische und Molekulare Virologie, FAU Erlangen-Nürnberg durchgeführt.