Negative selection is one of the mechanisms evolved by the immunesystem to prevent maturation of autoreactive B cells and is regulated by signals transduced through the B cell receptor (BCR). In immature B cells, ligation of the BCR leads to growth arrest followed by apoptosis, whereas in mature B cells it induces proliferation and differentiation. Furthermore, although in mature B cells BCR signalling occurs in lipid rafts, the BCR in immature B cells fails to enter these lipid microdomains. Thus, differences in the protein composition of lipid rafts might be responsible for the different outcome of BCR signalling. Using two dimensional gelelectrophoresis and mass spectrometry our group identified Swiprosin1 as a novel protein highly concentrated in lipid microdomains of the immature apoptosis sensitive B cell line WEHI 231, but not in lipid microdomains of the mature apoptosis resistant B cell line CH27LX. Therefore, the scope of this study was to investigate a potential role of Swiprosin1 in B cell apoptosis. Overexpression of Swiprosin1 in WEHI 231 cells resulted in a decrease in the mitochondrial membrane potential which led to the induction of spontaneous apoptosis concomitant with downregulation of the antiapoptotic factor Bcl-xL. Moreover, overexpression of Swiprosin1 enhanced BCR-mediated apoptosis by sensitising WEHI 231 cells to BCR stimulation. In contrast, downregulation of Swiprosin1 prevented spontaneous and BCR-induced apoptosis, but not BCR-elicited G1 cell cycle arrest. Furthermore, overexpression of Swiprosin 1 induced apoptosis in LPS stimulated immature B cells isolated from the bone marrow 24 hours after LPS treatment, whereas no proapoptotic effect was detected in LPS stimulated splenic B cells. However, pretreatment of WEHI 231 cells overexpressing Swiprosin1 with LPS protected these cells from spontaneous apoptosis. These data indicate firstly that Swiprosin1 exerts its proapoptotic effect specifically in the immature B cell stage and secondly that LPS counteracts that proapoptotic effect. Thus, prevention of Swiprosin1 induced cell death via LPS and decreased expression of Bcl-xL suggest a potential negative regulation of the transcriptional factor NF-κB by Swiprosin1. While this work was in progress another group observed that in epidermal growth factor receptor stimulated HeLa cells, Swiprosin1 had the same activation profile as proteins involved in reorganisation of the actin cytoskeleton. Thus, the question arose whether Swiprosin1 could induce apoptosis in B cells by influencing the actin cytoskeleton. In fact, enhancement of apoptosis in Swiprosin1 overexpressing cells correlated with a reduction of the cellular F-actin content. Accordingly, treatment of WEHI 231 cells with increasing concentrations of the F-actin disrupting drugs Latrunculin A and Cytochalasin D resulted in an increase of spontaneous as well as BCR-elicited apoptosis. These findings impose a role for Swiposin1 in the induction of B cell apoptosis by negatively regulating actin polymerisation. Taken together, these data point out, that in immature B cells, Swiprosin1 is involved in signalling pathways required for the BCR-mediated apoptosis.

Die negative Selektion spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der B-Zelltoleranz, die der Entstehung von autoreaktiven B-Zellen entgegenwirkt und unter anderem durch Signale des B-Zellrezeptors (BZR) reguliert wird. So löst die Kreuzvernetzung des BZRs in unreifen B-Zellen Zellzyklusarrest und Apoptose aus, wohingegen in reifen B-Zellen Proliferation und Differenzierung ausgelöst werden. Diese Unterschiede korrelieren mit dem unterschiedlichen Assoziationsverhalten des BZRs mit Lipidmikrodomänen. So initiiert in reifen B-Zellen die Kreuzvernetzung des BZRs seine Translokation in Lipidmikrodomänen, während in unreifen B-Zellen der BZR auch nach seiner Kreuzvernetzung von Lipidmikrodomänen ausgeschlossen bleibt. Somit könnten Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der Lipidmikrodomänen die unterschiedliche Signale des BZRs erklären. Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese von Lipidmikrodomänen und anschließender Massenspektrometrie konnte unsere Gruppe das neuartige Adaptorprotein Swiprosin1 identifizieren, das stark in Lipidmikrodomänen der unreifen, apoptoseempfindlichen B-Zelllinie WEHI 231 angereichert war, jedoch nicht in den Lipidmikrodomänen der reifen, apoptoseunempfindlichen B-Zelllinie CH27LX. Daher, war das Ziel dieser Arbeit, die potentielle Rolle von Swiprosin1 bei der Induktion der Apoptose in B-Zellen zu untersuchen. Die Überexpression von Swiprosin1 in WEHI 231 Zellen löste spontane Apoptose aus, induziert durch die Zerstörung des mitochondrialen Membranpotentials. Dies korrelierte gleichzeitig mit einer Abnahme der Expression des antiapoptotischen Faktors Bcl-xL. Außerdem verstärkte Swiprosin1 die BZR vermittelte Apoptose, indem es die Zellen gegenüber BZR-Signalen sensibilisierte. Im Gegensatz dazu schützte die Herunterregulierung von Swiprosin1 die Zellen vor der BZR induzierten Apoptose, ohne jedoch den G1-Zellzyklusarrest zu beeinflussen. Die Überexpression von Swiprosin1 in LPS vorbehandelten, primären, unreifen B-Zellen führte zur Induktion spontaner Apoptose, allerdings erst 24 Stunden nach der LPS-Stimulierung, wohingegen die Überexpression von Swiprosin1 in LPS vorbehandelten, primären, reifen B-Zellen keinen Einfluss auf die Apoptose hatte. In diesem Zusammenhang zeigte die Vorstimulierung der Swiprosin1 überexprimierenden WEHI 231 Zellen mit LPS einen schützenden Effekt vor der spontanen Apoptose. Diese Daten deuten daraufhin, dass Swiprosin1 seine proapoptotische Wirkung spezifisch im Stadium der unreifen B-Zellen ausübt und dass diese Funktion durch LPS aufgehoben wird. Diese Schutzfunktion von LPS wie auch die Herunterregulierung von Bcl-xL weisen auf einen potentiellen, negativen Einfluss von Swiprosin1 auf die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB hin, der für das Überleben der Zellen erforderlich ist. Im Verlauf dieser Arbeit beobachtete eine andere Gruppe, dass Swiprosin1 in HeLa Zellen nach epidermal growth factor receptor Stimulierung in der Reorganisation des Aktinzytoskeletts beteilig sein könnte. Diese Beobachtung warf die Frage auf, ob Swiprosin1 in B-Zellen durch die Beeinflussung des Aktinzytoskeletts Apoptose induzieren könnte. Die Untersuchungen des Aktinzytoskeletts ergaben, dass die Überexpression von Swiprosin1 zu einem reduzierten F-Aktingehalt führte, der mit der verstärkten Apoptoserate in diesen Zellen korrelierte. Dementsprechend führte die Behandlung der WEHI 231 Zellen mit zunehmenden Konzentrationen der aktindepolymerisierenden Toxine Latrunculin A und Cytochalasin D zur Induktion spontaner Apoptose wie auch zur Zunahme der BZR vermittelten Apoptose. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Swiprosin1 die Depolymerisation des Aktinzytoskeletts unterstützt und somit zur Induktion der Apoptose beiträgt. Zusammenfassend weisen diese Daten darauf hin, dass in unreifen B-Zellen Swiprosin1 in Signalwegen, die für die BZR vermittelte Apoptose erforderlich sind, eingreift und diese verstärkt.