Der Einfluss von Clomethiazol, Clozapin und Valproinsaeure auf die Expression von NPY und seinem Rezeptorsystem.
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Summary Background and aims Neuropeptide Y is a widely expressed peptide in the central and peripheral nervous system and has been found to be associated with many physiological functions. Acting via four different G-protein coupled receptors (Y1, Y2, Y4, Y5) it is involved in feeding behaviour and the pathology of obesity, anxiety, blood pressure, addiction and convulsion. Psychotropic drugs are designed to modulate those functions, even though little is known about the exact effects on cellular pathways. Gain of weight, epileptic or antiepileptic effects, sedation and anxiolysis are among the effects and side effects of valproic acid, clomethiazole and clozapine, suggesting that these drugs effect NPY and its receptor-system. The aim of the present study was to investigate the effects of valproic acid, clomethiazole and clozapine on gene expression of NPY and its receptors, which is a step towards understanding the drugs‘ mechanisms of action. Material and methods Human neuroblastoma cells, SH-SY5Y (SY5Y) and human embryonic kidney cells, HEK-293 (HEK) were stimulated with the above-named substances for 4, 24 and 48 hours. The employed drug-concentrations for incubation were determined using cytotoxicity-tests. The gene expression level of NPY and its receptors was measured by relative quantification using real-time dye-based PCR and the protein expression was analysed for selected genes using western blots. Results Stimulation with valproic acid showed a significant increase of gene expression of NPY, Y1, Y2 and Y5 in HEK-cells. Induction of Y1 was also seen in SY5Y-cells. Clomethiazole showed various effects on the NPY system, inhibiting the expression of Y2 and Y5 in HEK but increasing the expression of NPY and Y1 in SY5Y and also inhibiting Y2. Stimulation with clozapine showed only a decrease in expression for Y2 in HEK and no other significant results. Conclusions The results give evidence, that the effects and side effects of valproic acid (sedation, antiepileptic effects, anxiolysis, gain of weight) are correlated with modulation in gene-expression of NPY and its receptors. It could be shown that clozapine can only unfold its physiological effects (sedation, gain of weight, epileptic effects), if at all via affecting the NPY-system, through repression of Y2. Since the data of clomethiazole ist partly contrary to its physiological effects (sedation, anticonvulsion), the detectable and significant changes in gene-expression of the NPY-system are probably covered from other, physiologically stronger mechanisms. However, there are interesting ways of interpreting the repression of Y2 for the anxiolytic and also antiepileptic effects of clomethiazole and for the physiological effects of clozapine.
Abstract
Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Neuropeptid Y (NPY) ist ein weit verbreitetes und viel erforschtes Neuropeptid im zentralen und peripheren Nervensystem. Über vier verschiedene, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Y1, Y2, Y4, Y5) ist es als Transmitter an der Regulation vieler physiologischer Funktionen wie Essverhalten und Entstehung von Übergewicht, Angstverhalten, Krampfentwicklung, Blutdruck und Entstehung von Abhängigkeit beteiligt. Die Modulation dieser Funktionen ist Effekt vieler psychopharmakologischer Behandlungen, wobei der genaue Wirkmechanismus der Medikamente häufig noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Gewichtszunahme, antiepileptische Wirkung oder Senkung der Krampfschwelle, sowie Sedation und Anxiolyse, zählen zu den erwünschten und unerwünschten Wirkungen von Valproinsäure, Clomethiazol und Clozapin, und die Vermutung liegt nahe, dass diese Medikamente Teile ihrer Wirkungen über Modulation von Neuropeptid Y in Verbindung mit seinen vier Rezeptoren entfalten. So ist es das Ziel dieser Arbeit, herauszufinden, ob sich die Genexpression von Neuropeptid Y und seinen Rezeptoren unter Stimulation mit Valproinsäure, Clomethiazol und Clozapin verändert und so zur Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen dieser Medikamente beitragen. Material und Methoden Humane Neuroblastomzellen, SH-SY5Y (SY5Y) und humane, embryonale Nierenzellen, HEK-293 (HEK) wurden in Zellkulturexperimenten mit oben genannten Substanzen für je 4, 24 und 48 Stunden stimuliert. Die hierfür geeigneten Stimulationskonzentrationen wurden zuvor mittels eines Zytotoxizitätstests bestimmt. Die Ermittlung des Expressionsniveaus für NPY und seine Rezeptoren erfolgte relativ im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen durch eine quantitative PCR auf Ebene der Gentranskription und teilweise folgte im Western-Blot die Analyse der nachfolgenden Translation. Ergebnisse Nach Stimulation mit Valproinsäure zeigten sich in der HEK-Zelllinie signifikante Anstiege der Expression von NPY, Y1, Y2 und Y5. Die Induktion von Y1 ließ sich auch in den SY5Y Zellen zeigen. Clomethiazol zeigte variable Beeinflussung des NPY-Systems; während in den HEK-Zellen eine Inhibition von Y2 und Y5 nachweisbar war, führte es bei den Zellen der Linie SY5Y zu einer Induktion von NPY selbst und Y1 und ebenfalls zu einer Inhibition von Y2. Nach Stimulation mit Clozapin konnte bei der Zelllinie HEK eine verminderte Expression von Y2 festgestellt werden, alle anderen Untersuchungen zeigten keine signifikanten Veränderungen. Schlussfolgerungen Die Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass erwünschte und unerwünschte Wirkungen von Valproinsäure (Sedation, Antikonvulsion, Anxiolyse, Gewichtszunahme) durch Veränderung der Expression von NPY und seinen Rezeptoren mitverursacht werden. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass Clozapin seine Wirkungen (Sedierung, Gewichtszunahme, Senkung der Krampfschwelle), wenn sie überhaupt durch Veränderungen im NPY-System hervorgerufen werden, nur über die Beeinflussung von Y2 entfalten kann. Die Ergebnisse für Clomethiazol legen nahe, dass nachweisbare Veränderungen der Expression von NPY und seinen Rezeptoren teilweise durch physiologisch stärkere, andere Wirkungen überdeckt werden, da die nachgewiesenen zellulären Veränderungen partiell im Gegensatz zur antikonvulsiven und sedierenden Wirkung stehen. Insgesamt ergibt die Repression von Y2 interessante Interpretationsmöglichkeiten bezüglich der anxiolytischen und auch antikonvulsiven Wirkung von Clomethiazol und der physiologischen Wirkungen von Clozapin.