Funktionelle Analyse von Swiprosin-1 im proximalen B-Zellrezeptor Signalweg
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Swiprosin-1 is a potential adaptor protein that we identified in lipid rafts in the immature B cell line WEHI231. Lipid rafts are essential signalling platforms for the signalling capacity of the B cell receptor (BCR). At the beginning of this thesis it was known that overexpression of Swiprosin-1 leads to enhanced BCR-induced apoptosis and sets the threshold of the BCR. Therefore the hypothesis was that Swiprosin-1 regulates pro-apoptotic signals of the BCR. To test this, we analysed the influence of Swiprosin-1 expression on the BCR-signalling pathway. The amplification of BCR-induced apoptosis was reversed through NF-kB stimuli, namely BAFF, anti-CD40 and LPS. Moreover, the anti-apoptotic protein Bcl-xL was upregulated in Swiprosin-1 downregulated cells and vice versa upregulated after ectopic expression of Swiprosin-1. In accordance, Swiprosin-1 abundance showed no altered regulation of Bim or Erk. Instead of that, Swiprosin-1 downregulated WEHI231 cells showed enhanced phosphorylation and degradation of IkappaB-alpha after BCR stimulation. Thus, Swiprosin-1 regulates BCR-induced apoptosis by modulating Bcl-xL and NF-kappaB. Because of these findings and that Swiprosin-1 co-localizes with the BCR, the main hypothesis of this thesis was that Swiprosin-1 is involved in the proximal BCR-signalling pathway. Analysis of proximal signaling cascades in Swiprosin-1 overexpressing WEHI231 cells revealed an amplification of BCR-induced calcium flux. In contrast, BCR-elicited calcium flux was strongly attenuated in Swiprosin-1 downregulated cells due to a decreased calcium mobilization from intracellular stores. Complementation of Swiprosin-1 expression in Swiprosin-1 silenced WEHI231 cells restored the BCR-induced calcium flux. To identify the mechanism of this regulation the influence of Swiprosin-1 expression on BCR-induced total tyrosine phosphorylation and Syk activation was analysed. Thereby it was detected that Swiprosin-1 enhances early tyrosine phosphorylation of many proteins and that it regulates Syk activation positively. To analyse the molecular mechanism of Swiprosin-1 functional analyses by using deletion mutants were performed. Additionally, the calcium binding of Swiprosin-1 was tested in vitro, which showed a specific binding of calcium by the two EF-hands. Functional analyses in retrovirally transduced WEHI231 cells with myc tag Swiprosin-1 deletion mutants showed a strong reduction of BCR-induced calcium flux with the N-terminal ΔLC-, ΔPX and ΔCC mutants. Based on these findings a negative feed-back loop model was established about the role of Swiprosin-1 in the BCR-induced apoptosis. In this model Swiprosin-1 blocks NF-kappaB after direct binding of calcium and therefore counteracts tonic BCR survival signals.
Abstract
Swiprosin-1 ist ein potentielles Adaptorprotein, das wir verstärkt angereichert in den lipid raft Fraktionen der unreifen, apoptoseempfindlichen B-Zelllinien WEHI231 nachweisen konnten. Für die intrazelluläre Signaltransduktion in B-Zellen stellen lipid rafts eine wichtige Rolle als Signalplattform für den B-Zellrezeptor (BZR) dar. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass eine Swiprosin-1 Überexpression sowohl eine Herabsetzung des BZR-Schwellenwertes als auch eine Amplifizierung der BZR-induzierten Apoptose bewirkt. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass Swiprosin-1 pro-apoptotische Signale des BZR reguliert. Um dies zu überprüfen wurde der Einfluß der Swiprosin-1 Expression auf den BZR-Signalweg untersucht. Der amplifizierende Effekt von Swiprosin-1 auf den BZR-induzierten Zelltod konnte durch die Stimulierung mit LPS, anti-CD40 und BAFF rückgängig gemacht werden. Darüberhinaus war in Swiprosin-1 herunterregulierenden WEHI231 Zellen das anti-apoptotische Protein Bcl-xL hochreguliert, wohingegen die Swiprosin-1 überexprimierenden Zellen eine deutliche Abnahme der Proteinmenge von Bcl-xL zeigten. Veränderungen der Swiprosin-1 Expression zeigten aber keinen Einfluss auf die Erk-Aktivierung oder die Bim Expression. Stattdessen zeigten sich in Swiprosin-1 herunterregulierenden WEHI231 Zellen eine verstärkte Phosphorylierung sowie eine Degradation von IkappaB-alpha nach BZR-Stimulierung. Dies zeigt, dass Swiprosin-1 die BZR-induzierte Apoptose über die Regulierung von NF-kappaB und Bcl-xL moduliert. Aufgrund dieser Daten und der Beobachtung, dass Swiprosin-1 mit dem BZR kolokalisiert, war die zentrale Hypothese dieser Arbeit, dass Swiprosin-1 an der proximalen BZR-Signaltransduktionskaskade beteiligt ist. Die Analyse der proximalen BZR-Signalkaskade in Swiprosin-1 überexprimierenden WEHI231 Zellen zeigte eine verstärkte BZR-induzierte Kalzium-Mobilisierung. Hingegen wiesen Swiprosin-1 herunterregulierende WEHI231 Zellen einen stark abgeschwächten BZR-induzierten Kalziumflux aufgrund einer reduzierten Kalzium-Mobilisierung aus den intrazellulären Speichern auf. Eine Rekonstituierung der Swiprosin-1 Expression in Swiprosin-1 herunterregulierenden Zellen führte zu einer kompletten Wiederherstellung des BZR-induzierten Kalziumflux. Um den Mechanismus dieser Regulierung zu identifizieren wurde der Einfluss der Swiprosin-1 Expression auf die BZR-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung und die Syk-Aktivität untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass Swiprosin-1 die frühe Tyrosin-Phosphorylierung vieler Proteine als auch die Syk-Aktivierung positiv reguliert. Um den Wirkmechanismus von Swiprosin-1 zu analysieren, sollte die funktionelle Relevanz der Proteindomänen von Swiprosin-1, insbesondere die Kalzium-Bindung der EF-Hände untersucht werden. In vitro Untersuchungen zeigten, dass Swiprosin-1 spezifisch Kalzium-Ionen über seine EF-Hände bindet. Die Funktionsanalysen wurden durch die Herstellung und anschließende retrovirale Transduktion von Myc-Tag Swiprosin-1 Deletionsmutanten in Swiprosin-1 herunterregulierenden WEHI231 Zellen ermöglicht. Dabei zeigte sich, dass die N-terminalen deltaLC-, deltaPX- und deltaEF1-Deletionsmutanten kaum noch eine BZR-induzierte Kalzium-Mobilisierung aufwiesen. Aufgrund dieser Daten wurde ein mögliches negatives feed-back loop Modell zur Rolle von Swiprosin-1 in der BZR-induzierten Apoptose aufgestellt, indem Swiprosin-1 über direkte Kalzium-Bindung NF-kappaB blockiert und somit tonischen BZR-Überlebensignalen entgegenwirkt.