Zellzyklusregulierte Transkription in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae: Funktionelle Analyse der Transkriptionsfaktoren SBF und MBF und ihrer Untereinheiten Swi4, Mbp1 und Swi6
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When a new cell cycle is started in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae at the end of G1 expression of a large number of cell division specific genes must be initiated through the two transcription factors SBF (SCB binding factor) and MBF (MCB binding factor). These heteromeric complexes are composed of the related proteins Swi4 and Swi6 (SBF) and Mbp1 and Swi6 (MBF) respectively. Only Swi4 and Mbp1 contain a DNA-binding domain at their N-terminus allowing them to bind SCB (Swi4/Swi6 cell cycle box) or MCB elements (MluI cell cycle box), which are located in the promoters of their target genes. Such elements are found before a set of cyclin genes, the gene for the HO-endonuclease or genes encoding proteins necessary for DNA-synthesis and budding. The subunits of SBF and MBF interact through their C-termini, interactions with other proteins are thought to occur through the central Ankyrin region. While Swi4 and Mbp1 are consistently localized in the nucleus, Swi6 is exported periodically as a substrate of the Msn5 transportin out of the nucleus and is subsequently reimported. To characterize the different functions of these subunits and to study the mechanism of regulated gene activation the three factors and a set of deletion variants thereof were analyzed in WT and mutant strains with regard to the activation and regulation of reporter genes. Additionally, a model for the cooperation of the three proteins during the cell cycle was derived. Furthermore the localization of Swi4, Swi6 and Mbp1 and their ability for complementation of swi6 mutants was analyzed. It is shown that all three subunits can independently activate transcription, but regulated SBF- and MBF-mediated transcription during the cell cycle can only take place when interaction between their C-termini is possible. Therefore a C-terminal deletion of Swi4 and Swi6 results in a constitutive activation of a LEU2 reporter gene. In contrast regulated activation is observed through the isolated C-termini as long as they are long enough for interaction with their partner molecules. In some cases, however, the timing of gene activation is different when isolated C-termini are used instead of whole proteins. These results show that the function of Swi4 and Mbp1 can not be simply reduced to recruting Swi6 to the promotor. Swi6 also mediates gene activation in swi4 und mbp1 mutant strains whereas Swi4 and Mbp1 seem to block DNA-binding intramolecular in swi6 mutants through their own C-termini. Only after interaction with Swi6 in WT cells the DNA-binding domain is released. While Swi6 posses activating regions in its N- and C-terminal halves, such regions are restricted in Swi4 to the C-terminus and in Mbp1 to the N-terminus. It wasn’t yet possible to identify nuclear localization signals for neither Swi4 nor Mbp1 though both proteins localize constitutively to the nucleus. The transport of Swi6 from the nucleus to cytoplasm does not influence the ability of SBF and MBF for regulated gene activation but it modifies the transcription pattern during the different cell cycle phases. msn5 mutants, for example, show a delayed activation of transcription at START. The results led us to the following model: the interaction between the three subunits is necessary to allow the contact of SBF and MBF with further regulatory proteins like Stb1 or Whi5 which determines the correct time point for the start of transcription in the end of G1.
Abstract
In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae muss für den Start eines neuen Teilungszyklus am Ende der G1 Phase die Expression einer Vielzahl von zellteilungsspezifischen Genen durch die Transkriptionsfaktoren SBF (SCB binding factor) und MBF (MCB binding factor) initiiert werden. Die heteromeren Komplexe setzen sich aus den verwandten Proteinen Swi4 und Swi6 (SBF) und Mbp1 und Swi6 (MBF) zusammen, wobei nur Swi4 und Mbp1 jeweils N-terminal gelegene DNA-Bindedomänen enthalten, mit denen sie an SCB (Swi4/Swi6 cell cycle box) bzw. MCB Elemente (MluI cell cycle box) in den Promotoren der entsprechenden Gene binden. Solche Elemente finden sich unter anderem vor einigen Cyclin-Genen, dem HO-Endoukleasegen und Genen für Proteine der DNA-Synthese und zur Knospen- und Spindelausbildung. Über eine C-terminal gelegene Interaktionsdomäne sind die Untereinheiten in der Lage, miteinander zu wechselwirken; die zentrale Ankyrinregion dient zur Interaktion mit weiteren Proteinen. Swi4 und Mbp1 lokalisieren konstant im Zellkern, während Swi6 als Substrat des Transportins Msn5 periodisch aus dem Kern exportiert und anschließend reimportiert wird. Zur Klärung der verschiedenen Funktionen der Untereinheiten und den Mechanismus der von ihnen vermittelten regulierten Genaktivierung wurden in dieser Arbeit die einzelnen Faktoren und davon abgeleitete Deletionsfragmente in WT und Mutantenstämmen im Hinblick auf Aktivierung und Regulation von Genen analysiert und ein Modell für das Zusammenwirken der drei Proteine im Zellzyklus entwickelt. Berücksichtigt wurden dabei auch die Lokalisierung der Faktoren sowie deren Fähigkeit zur Komplementation von swi6 Mutanten. Es stellte sich heraus, dass zwar alle drei Untereinheiten unabhängig aktivierende Funktion besitzen, dass die SBF- und MBF-vermittelte Transkription aber nur dann im Zellzyklus reguliert ist, wenn Interaktion zwischen deren C-Termini stattfinden kann. So aktivieren Swi4 und Swi6 ohne C-Terminus ein Reportergen unreguliert während des ganzen Zellzyklus. Bei den isolierten C-Termini kann dagegen regulierte Aktivierung beobachtet werden, solange sie lang genug für die Wechselwirkung mit ihren jeweiligen Interaktionspartnern sind, wenngleich sich das Transkriptionsmuster von dem der unverkürzten Proteine zum Teil unterscheidet. Somit kann die Funktion von Swi4 und Mbp1 nicht auf die bloße Rekrutierung von Swi6 an den Promotor reduziert werden. Swi6 vermittelt auch in swi4 und mbp1 Mutanten Genaktivierung, wohingegen sich Swi4 und Mbp1 in swi6 Mutanten durch ihren C-Terminus bei der DNA-Bindung selbst zu blockieren scheinen. Erst durch Interaktion mit Swi6 wird im WT die DNA-Bindedomäne frei. Während Swi6 sowohl in der N- als auch der C-terminalen Hälfte aktivierende Bereiche besitzt, finden sich diese bei Swi4 nur in der N-, bei Mbp1 nur in der C-terminalen Hälfte. Weder Swi4 noch Mbp1 besitzen bisher identifizierte Kernlokalisierungssequenzen, lokalisieren aber konstant im Kern. Der Transport von Swi6 aus dem Zellkern hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit von SBF und MBF zur regulierten Genaktivierung, wohl aber auf das Transkriptionsmuster zu den verschiedenen Zellzyklusphasen. So zeigen msn5 Mutanten mit einer Deletion des Exportins Msn5 Verzögerungen bei der Aktivierung bei START. Die Ergebnisse führten zu einem Modell, nach dem die Interaktion der drei Faktoren notwendig ist, um Wechselwirkung von SBF und MBF mit weiteren Regulatorproteinen wie Stb1 oder Whi5 zu erlauben und so den richtigen Zeitpunkt für den Transkriptionsstart am Ende der G1-Phase zu bewirken.