Targeting the human immunodeficiency virus type-1 Gag protein into the defective ribosomal product pathway enhances its MHC class Iantigen presentation
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The major source for endogenous peptides presented via the major histocompatibility complex class-I (MHC-I) pathway are de novo synthesized, dysfunctional proteins, named defective ribosomal products (DRiPs), which are degraded in concert with or shortly after their synthesis by the ubiquitin proteasome system (UPS). The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag polyprotein, a bona fide substrate of the DRiP-pathway, was chosen as a model antigen to more precisely understand the relevance of erroneous protein synthesis for the generation of MHC-I-presented peptides. To target Gag into the DRiP-pathway, various degradation signals have been introduced into Gag, and their effects on its protein synthesis, metabolic half-life, DRiP-formation as well as subcellular localization and the release of virus like particles have been investigated. As an indicator for antigen processing, the ovalbumin-derived SIINFEKL (SL) epitope was introduced into Gag expressed from a codon-optimized gag gene (syngag). It was demonstrated that exchange of the N-terminal Met residue for Arg (RGag), a destabilizing amino acid according to the N-end rule, directed Gag more efficiently into the DRiP-pathway in murine EL4 cell lines. This correlated with enhanced MHC-I antigen presentation as well as more efficient CD8+ T-cell activation in vitro and in vivo. The enhanced MHC-I presentation of SL derived from RGag in murine cells could be reproduced in a human cell line. Furthermore, stable fusion to ubiquitin (Ub), converting Gag into a substrate for the Ub fusion degradation (UFD) pathway, was even more efficient in targeting Gag into the MHC-I pathway. The PTAP late (L)-domain motif in the p6 domain of HIV-1 Gag plays an essential role during late stages of budding and has been recently implicated in the control of Gag ubiquitination. Mutations of PTAP in the context of syngag- or HIV-1-encoded Gag increased the ubiquitination as well as the DRiP-rate of Gag and enhanced the MHC-I presentation of the Gag-derived SL epitope. This novel function of the PTAP L-domain as a naturally occurring motif that regulates the DRiP-rate of Gag might be mediated by the sequence-specific recruitment of cellular factors, most likely components of the UPS. Altogether, the results presented in this study further underline the role of the DRiP-pathway in adaptive immunity and provide strategies to enhance the MHC-I antigen presentation of HIV-1 Gag and other antigens. It remains to be elucidated by studies performed in vivo whether such approaches may help to improve vaccination strategies.
Abstract
Die Hauptquelle für endogene Peptide, die von MHC Klasse I (MHC-I) Molekülen präsentiert werden sind Fehlprodukte der Proteinbiosynthese, sogenannte defekte ribosomale Produkte (DRiPs), die noch während oder kurz nach ihrer Synthese durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) abgebaut werden. Um die Bedeutung der fehlerhaften Proteinsynthese für die MHC-I Antigenpräsentation weiter zu untersuchen, wurde das Gag Polyprotein des humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1), ein beschriebenes Substrat des DRiP-Pathways, als Modellantigen gewählt. Um Gag in den DRiP-Pathway zu lenken, wurden verschiedene Abbausignale eingeführt und deren Wirkung auf die Synthese, metabolische Halbwertszeit, DRiP-Rate sowie subzelluläre Lokalisation von Gag und die Freisetzung von Virus-ähnlichen Partikeln untersucht. Als Indikator für die Antigenprozessierung wurde das SIINFEKL (SL) Epitop aus Ovalbumin in Gag eingebracht, welches von einem synthetischen, Kodon-optimierten gag Gen (syngag) exprimiert wurde. Es wurde gezeigt, dass der Austausch des N-terminalen Methionins durch Arginin (RGag), welches entsprechend der „N-end Regel“ ein Abbausignal darstellt, zu verstärkter Bildung von Gag-DRiPs in murinen EL4 Zellen führt. Dies korrelierte mit erhöhter MHC-I Antigenpräsentation sowie einer effizienteren T-Zellaktivierung in vitro und in vivo. Die bessere Antigenprozessierung von RGag in murinen Zellen konnte in einer humanen Zellinie bestätigt werden. Darüber hinaus leitete eine stabile N-terminale Fusion von Ubiquitin das Protein noch weitaus effizienter in den MHC-I Pathway. Das PTAP late (L)-Domänen Motiv in der p6 Domäne von HIV-1 Gag spielt eine essentielle Rolle in späten Stadien der Virusfreisetzung und reguliert die Ubiquitinylierung von Gag. Mutationen von PTAP im Kontext von syngag- oder HIV-1 kodiertem Gag erhöhen die Ubiquitinylierung und DRiP-Rate und steigern die MHC-I Präsentation des SL-Epitops. Diese neu beschriebene Funktion des PTAP Motivs als ein inhärentes Sequenzmotiv, welches den Eintritt von Gag in den MHC-I Pathway reguliert, könnte durch die sequenzspezifische Interaktion mit zellulären Faktoren, insbesondere Bestandteile des UPS, vermittelt werden. Zusammengefasst unterstreichen diese Befunde die Rolle des DRiP-Pathways in der adaptiven Immunität and zeigen mögliche Strategien auf, mit Hilfe derer die MHC-I Präsentation von HIV-1 Gag oder anderen Antigenen gesteigert werden könnte. Dennoch bedarf es weiterer Untersuchungen in vivo, um zu klären, ob auf diese Weise Vakzinierungsstrategien verbessert werden könnten.