Untersuchung der Interaktion humaner IgG Antikörper mit humanen FcgR in vitro und in vivo
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Immunoglobulin G (IgG) antibodies are an essential part of the adaptive immune system. Genetic defects leading to a reduced production or a complete lack of this antibody isotype are associated with an increased susceptibility to infectious diseases. Studies of the murine immune system suggest that the biological activity of IgG is mainly mediated by their binding to Fcg receptors (FcgR) expressed on almost all cells of the innate immune system. The aim of the thesis was to analyse which factors influence the biological activity of IgG in vitro and in vivo. We performed in vitro interaction studies of human immune complexes and human FcgR which suggested a correlation of immune complex size and binding to FcgRIIA, FcgRIIB and FcgRIIIA, but not FcgRIA. In addition, we could show that a lack of glycosylation on asparagine 297 impairs binding to low affinity FcgR. However, this reduced binding could be overcome by increasing the size of the immune complexes. Polymorphisms of the human FcgR pose another factor influencing the interaction with IgG antibodies. To study this, we analysed genetic variants of the activating FcgR, FcgRIIA131H/R and FcgRIIIA158F/V. In vitro binding studies showed an enhanced affinity of FcgRIIA131H for all human IgG subclasses. To study IgG induced effector functions in vivo we developed a humanized mouse model which mirrors the genetic complexity of the human immune system. Immunodeficient Rag2/gc/Fcg-/- mice transplanted with human hematopoetic stem cells developed a human immune system as shown by the appearance of B and T lymphocytes, NK cells, myeloid cells and dendritic cells. Effector cells such as monocytes and NK cells displayed expression levels of human FcgRs comparable to their human counterparts. This new humanized mouse model was used to study the influence of FcgRIIA131H/R and FcgRIIIA158F/V polymorphisms on the biological activity of IgG antibodies such as the induction of antibody induced cell mediated cytotoxicity (ADCC). B cell depletion induced by the injection of anti-CD20 IgG antibodies greatly depended on the constant region of the antibody. Furthermore, IgG subclasses showed a distinct in vivo activity. Preliminary data also suggest an enhanced IgG2 mediated B cell depletion in the presence of FcgRIIA131H and FcgRIIIA158V.
Abstract
Immunglobulin G (IgG) Antikörper sind ein essentieller Bestandteil des adaptiven Immunsystems. Genetische Defekte, die zu einer verminderten Bildung bzw. dem vollständigen Fehlen dieses Antikörper-Isotyps führen, gehen mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit einher. Eine Vielzahl von Studien in der Maus deuten darauf hin, dass insbesondere Fcg Rezeptoren (FcgR), die auf fast allen Zellen des angeborenen Immunsystems exprimiert werden, eine wichtige Rolle für die Aktivität von IgG Antikörpern spielen. In der vorliegenden Arbeit sollte daher untersucht werden, ob die Aktivität von humanen IgG Antikörpern von ähnlichen Faktoren in vitro und in vivo beeinflusst wird. Durch in vitro Bindungsstudien von humanen Immunkomplexen an humane FcgR konnte im ersten Teil dieser Arbeit ein Zusammenhang zwischen der Größe von Immunkomplexen und der Bindung an FcgRIIA, FcgRIIB und FcgRIIIA, nicht aber an FcgRIA, gezeigt werden. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Immunkomplexe ohne die Glykosylierung am Asparagin 297 eine verminderte Bindung an die niedrigaffinen FcgR aufweisen. Große Immunkomplexe konnten die durch Deglykosylierung bedingte reduzierte Affinität teilweise kompensieren. Einen weiteren möglichen Einflussfaktor auf die IgG-FcgR Interaktion stellen Polymorphismen in den humanen FcgR dar. In dieser Arbeit wurden genetische Varianten der aktivierenden FcgR, FcgRIIA131H/R und FcgRIIIA158F/V, untersucht. In in vitro Analysen wies FcgRIIA131H für alle humanen IgG Isotypen eine erhöhte Affinität auf. Für die in vivo Analyse IgG-vermittelter Effektorfunktionen wurde ein humanisiertes Mausmodell etabliert, in dem die genetische Komplexität des humanen Immunsystems abgebildet wird. Hierfür wurden immundefiziente Rag2/gc/Fcg-/- Mäuse verwendet, die nach Transplantation mit humanen hämatopoetischen Stammzellen ein humanes Immunsystem mit B- und T-Lymphozyten sowie NK-Zellen, Monozyten und dendritischen Zellen entwickelten. Weiterhin zeigten die humanen Effektorzellen, wie etwa Monozyten und NK-Zellen, ein dem Menschen vergleichbares Expressionsmuster der humanen FcgR. In diesem neuen humanisierten Mausmodell wurde der Zusammenhang zwischen den FcgRIIA131H/R und FcgRIIIA158F/V Polymorphismen und der biologischen Wirksamkeit von IgG beispielhaft durch die Induktion der Antikörper-induzierten Zell-vermittelten Zytotoxizität (ADCC) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die durch Injektion von anti-CD20 IgG verursachte Depletion von humanen B-Zellen vom konstanten Teil des IgG Antikörpers abhängt. Zudem zeigten die verschiedenen IgG Subklassen eine unterschiedliche Aktivität und es konnten erste Hinweise gewonnen werden, die vermuten lassen, dass die IgG2-vermittelte Depletion in Gegenwart der hochaffinen Varianten der aktivierenden Fc Rezeptoren FcgRIIA131H bzw. FcgRIIIA158V verstärkt war.