Analyse der Effekte einer direkten Stimulation der löslichen Guanylatzyklase auf die Entwicklung der diabetischen Nephropathie in der Ratte
Language
Document Type
Issue Date
Issue Year
Authors
Editor
Abstract
2.1 Introduction Diabetic nephropathy is one of the leading causes of chronic renal failure in the western world. The continuing damage of capillaries and the microvascular endothelium is an essential factor for the progression of the disease. Mainly in vivo studies demonstrate that the nitric oxide system plays a decisive role for the initiation of hemodynamic changes like glomerular hypertension and hyperfiltration. A general assumption is that the hyperglycemia induced insufficiency of the nitric oxide system leads to glomerular endothelial dysfunction. Activity of soluble guanylate cyclase (sGC) is associated with local regulation of hemodynamics and glomerular function in the kidney. It is directly stimulated by nitric oxide and mediates the majority of nitric oxide effects. Recently, a group of novel pyrazolopyridine derivatives as NO-independent sGC-stimulators (e.g. Bay 41-2272) have been described. In the present study the therapeutic potential of direct sGC-stimulation using the pyrazolopyridine Bay 41-2272 in experimental diabetic nephropathy was investigated. 2.2 Methods Experimental diabetes mellitus was induced in 45 male Sprague-Dawley rats by a single injection of streptozotocin (60mg/kg bw). Two weeks after disease induction rats were divided into three groups. One group received 10mg/kg bw of the NO-independent sGC-stimulator Bay 41-2272 via daily orally gavage (Bay 41-2272-group). Other groups received either solvent solution (placebo-group) or solvent solution and a standard antihypertensive triple therapy consisting of reserpine, hydralazine and hydrochlorthiazide per tap water (antihypertensives-group). Therapy was maintained for a period of 21 weeks. After sacrifice, renal biopsies, glomerular isolates, urine- and blood-samples were collected. Changes in progression of diabetic nephropathy were investigated by immunohistochemistry, immunoassay, real-time PCR and western blot analysis. 2.3 Results Fourteen days after disease induction and during the 21 weeks of therapy blood glucose levels were significantly increased (400-600mg/dl) with no differences between the groups, thereby verifying successful induction of diabetes mellitus. Analysis of the intracellular concentration of cGMP, which is produced by sGC, demonstrated no differences between the groups. Furthermore, renal function was investigated by measurements of the serum-creatinine concentration and demonstrated a significant increase in the group exposed to sGC-stimulation. After 21 weeks of therapy tubulointerstitial regions of the kidneys showed significantly increased fibrosis and a tendency towards enhanced glomerulosclerosis in the Bay 41-2272-group. Evaluation of matrix-structure proteins like collagen I, collagen IV and fibronectin in immunohistochemistry subsequently showed increased matrix deposition in the group with sGC-stimulation compared to control groups. Results of the collagen I-expression were confirmed in western blot analysis. These effects could not be explained by increased cell-proliferation, activation of the TGF-β-pathway or inflammation-process. 2.4 Conclusion In the present study direct sGC-Stimulation does not exert beneficial effects on the development of diabetic nephropathy in rats. In contrast, functional parameters in parallel to tubulointerstitial fibrosis and matrix deposition were worse. In comparison to other studies efficacy of sGC-stimulation could not be shown and further studies are necessary to investigate these drugs in diabetic nephropathy.
Abstract
1.1 Hintergrund und Ziele Die diabetische Nephropathie ist eine der Hauptursachen für chronische und dialysepflichtige Nierenerkrankungen in der westlichen Welt. Die fortgesetzte Schädigung der Kapillaren und des mikrovaskulären Endothels im Sinne einer Mikroangiopathie stellt einen wesentlichen Progressionsfaktor dar. Einige in vivo Studien zeigen, dass das Stickstoffoxid-System eine wichtige Rolle bei der Initiierung der hämodynamischen Veränderungen, wie der glomerulären Hyper-perfusion und Hyperfiltration, spielt. Im Allgemeinen geht man davon aus, dass die durch Hyperglykämie induzierte Insuffizienz des Stickstoffoxid-Systems zu endothelialen Funktionsstörungen in den Glomeruli führt. Die lösliche Guanylat-zyklase ist ein wichtiger Bestandteil der Signaltransduktion für die lokale Regulation von hämodynamischen und glomerulären Funktionen in der Niere. Sie wird durch Stickstoffmonoxid direkt stimuliert und vermittelt so einen Großteil der zellulären Stickstoffmonoxid-Effekte. Vor einigen Jahren wurde eine Gruppe von neuartigen Pyrazolopyridin-Derivaten (z.B. Bay 41-2272) beschrieben, die als NO-unabhängige Stimulatoren der löslichen Guanylatzyklase fungieren. In der vorliegenden Arbeit wurde das therapeutische Potential einer direkten Stimulation der sGC durch Bay 41-2272 anhand der experimentellen diabetischen Nephropathie der Ratte untersucht. 1.2 Methoden In 45 männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurde durch eine einmalige Injektion von Streptozotocin (60mg/kg KG) ein Diabetes mellitus induziert. Zwei Wochen nach Induktion der Erkrankung wurden die Ratten in drei verschiedene Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe erhielt 10mg/kg KG des NO-unabhängigen sGC-Stimulators Bay 41-2272 durch tägliche orale Gavage (Bay 41-2272-Gruppe). Die anderen Ratten erhielten entweder das Lösungsmittel der Substanz (Placebo-Gruppe) oder das Lösungsmittel und eine Standard-Antihypertensiva-Therapie bestehend aus Reserpin, Hydralazin und Hydrochlorthiazid über das Trinkwasser (Antihypertensiva-Gruppe). Die Behandlungsdauer wurde auf einen Zeitraum von 21 Wochen festgelegt. Nach Tötung der Tiere wurden Nierenbiopsien, Glomerulipräparate, Urin- und Blutproben entnommen. Die Veränderungen in der Progression der diabetischen Nephropathie wurden durch Immunhistochemie, Immunoassay-Verfahren, Real-Time PCR und Western Blot-Analysen untersucht. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Die Blutglukosewerte aller Tiere, als Indikatoren für einen bestehenden Diabetes mellitus, zeigten 14 Tage nach Krankheitsinduktion und während der 21 Therapiewochen signifikant erhöhte Konzentrationen (400-600mg/dl), wobei es zwischen den Gruppen keine Unterschiede gab. Die Analysen der intrazellulären Konzentration von cGMP, welches durch die sGC produziert wird, konnten keinen Unterschied zwischen den Gruppen belegen. Die Nierenfunktion, gemessen anhand der Serumkreatininkonzentration, zeigte in der Gruppe mit der sGC-Stimulation signifikant erhöhte Werte. Nach 21 Wochen Therapie zeigten tubulointerstitielle Bereiche der Nieren eine signifikant erhöhte Fibrosierung sowie eine marginale Zunahme der Glomerulosklerose in der Bay 41-2272-Gruppe. Die Evaluierung von Matrixstrukturproteinen, wie Kollagen I, Kollagen IV und Fibronektin, mittels der Immunhistochemie ergab folglich vermehrte Ablagerungen in der Gruppe mit dem sGC-Stimulator gegenüber den beiden anderen Gruppen. Western Blot-Analysen bestätigten dies in Bezug auf die Kollagen I-Expression. Diese Effekte konnten nicht über eine gesteigerte Zellproliferation, eine Aktivierung des TGF-β-Signalweges oder Einschwemmung von Entzündungszellen erklärt werden. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Im vorliegenden Experiment führte die direkte sGC-Stimulation im Verlauf der diabetischen Nephropathie in der Ratte zu keiner Verbesserung des Erkrankungs-verlaufs, hingegen aber zu einer funktionellen Verschlechterung in Verbindung mit einer erhöhten tubulointerstitiellen Fibrosierung und einer vermehrten Ablagerung von Matrixproteinen. Da im Gegensatz zu vorausgehenden Studien die Effizienz der sGC-Stimulation nicht belegt werden kann, bedarf es zur abschließenden Beurteilung weiterer Anschlussexperimente, die dann bei nachgewiesener cGMP-Erhöhung eine erneute Evaluation dieser Substanzklasse ermöglichen.