The snoRNAs MBII-52 and MBII-85 are processed into smaller RNAs and regulate alternative splicing
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Abstract
Recent results from deep-sequencing and tiling array studies indicated the existence of a large number of short, metabolically stable, non-coding RNAs. Some of these short RNAs are derived from known RNA classes like snoRNA or tRNAs. There are intriguing similarities between short non-coding nuclear RNAs and oligonucleotides used to change alternative splicing events, usually targeting a disease-relevant RNA. The loss of HBII-52 and HBII-85 related C/D box small nucleolar RNA (snoRNA) expression units have been implicated as a cause for the Prader-Willi syndrome (PWS). We recently found that the C/D box snoRNA HBII-52 changes the alternative splicing of the serotonin receptor 2C pre-mRNA, which is different from the traditional C/D box snoRNA function in non-mRNA methylation. Using bioinformatic predictions and experimental verification, we identified five pre-mRNAs (DPM2, TAF1, RALGPS1, PBRM1 and CRHR1) containing alternative exons that are regulated by MBII-52, and two pre-mRNA (PTBP1 and HAGHL) containing alternative exons that are regulated by MBII-85, the mouse homologs of HBII-52 and HBII-85, respectively. Analysis of a single copy of MBII-52 and MBII-85 from their respective clusters, by RNase protection and northern blot analysis shows that these expression units generates shorter RNAs that originate from the full-length snoRNA through additional processing steps. These novel RNAs associate with hnRNPs and not with proteins associated with canonical C/D box snoRNAs. Our data indicate that not a traditional C/D box snoRNAs MBII-52 and MBII-85, but a processed version lacking the snoRNA stem are the predominant MBII-52 and MBII-85 RNAs missing in PWS. These processed snoRNAs function in alternative splice-site selection. Their substitution could be a therapeutic principle for PWS. We developed a new and reliable method to clone small dsRNAs from the RNase protection assay. The advantage of this method over other published methods that cloning can be done even with small amount of starting material. We also developed a faster method to clone minigenes for cell based minigene assays.
Abstract
Die Entwicklung neuer Techniken, wie deep-sequencing und tiling DNA arrays führte zur Entdeckung einer Vielzahl kurzer, metabolisch stabiler RNAs, die keinerlei Leseraster für Proteine enthalten. Einige dieser RNAs entstehen aus bekannten RNA Klassen, wie snoRNAs, (small nucleolar RNAs) und tRNAs (transfer RNAs). Diese neuen RNAs weisen ähnliche Eigenschaften wie Oligonukleotide auf, die schon seit langer Zeit zur Veränderung der prä-mRNA Prozessierung verwendet werden. Der Verlust der Expression der snoRNAs HBII-52 und HBII-85 ist die wahrscheinliche Ursache für das Prader-Willi Syndrom. In früheren Arbeiten konnte die Gruppe zeigen, dass die snoRNA HBII-52 die alternative prä-mRNA Prozessierung des Serotonin Rezeptors 5 HT2C reguliert. Dies ist eine neue Funktion von snoRNAs, von denen bisher nur bekannt war, das sie die Methylierung und Pseudouridinylierung von nicht-mRNAs regulieren. In dieser Arbeit benutzten wir bioinformatische Vorhersagen und experimentelle Untersuchungen um neue Zielgene für HBII-52 und HBII-85 zu identifizieren. Wir fanden fünf mRNA, deren alternative Exons von HBII-52 reguliert wurden (DPM2, TAF1, RALGPS1, PBRM1 und CRHR1). Für HBII-85 identifizierten wir zwei Zielgene: PTBP1 und HAGHL. Um den Wirkungsmechanismus der snoRNAs aufzuklären, analysierten wir die Expression von MBII-85 und MBII-52 mit RNAse protection. Hierbei stellte sich heraus, dass aus den snoRNAs kürzere RNAs durch einen zusätzlichen Prozessierungsschritt entstehen. Die neuen RNAs sind nicht mit snoRNA-typischen Proteinen verbunden, sondern binden an hnRNPs, ähnlich wie RNA Oligonucleotide. Um diese RNAs zu klonieren, entwickelten wir ein neues Verfahren, um geringe Mengen doppelsträngiger RNA (dsRNA) aus RNAse protection Experimenten zu klonieren. Hiermit konnten wir zeigen, dass die am stärksten exprimierten Formen von HBII-52 und HBII-85 keine für snoRNA typischen komplementären Enden aufweisen. Unsere Daten zeigen, dass nicht der Verlust typischer snoRNAs die Ursache für das Prader-Willi Syndrom ist, sondern der Verlust kürzerer, prozessierter snoRNAs, die wir psnoRNAs nennen. Die Substitution von psnoRNAs könnte ein therapeutischer Ansatz für PWS sein.