Funktionelle Untersuchungen zu Protein-Protein Interaktionen ligandengesteuerter Neurotransmitter-Rezeptoren
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The neuronal signal transduction is composed of a precisely coordinated and highly regulated linkage of excitatory an inhibitory signalling pathways. The metabotropic glutamate receptor type 8 (mGluR8) and the ionotropic GABAC-receptor (GABACR) modulate the processing of visual information in the retina. Both receptors are regulated by intracellular binding partners. Previous work identified putative interaction partners in yeast cells. This work verified the protein-protein interaction of the band 4.1B protein with mGluR8a/b. Co-localization was detected in retinal tissue as well as in transfected HEK-293 cells and hippocampal neurons. Functional consequences of this interaction were analyzed via a biotinylation assay, that revealed an increased surface expression of the glutamate receptor when co-expressed with band 4.1B proteins. In addition, co-expression with band 4.1B proteins led to an inhibition of the receptor-mediated reduction of intracellular cAMP-levels. Furthermore, PIAS1/3 and Ubc9 as important enzymes of the SUMOylation cascade have also been identified in the lab as putative mGluR8b interaction partners. These protein-protein interactions were verified in this work, as well. The lysine residues responsible for mGluR8b-SUMOylation were identified via site-directed mutagenesis of mGluR8b. The expression of SUMOylating enzymes was detected in retinal tissue via RT-PCR. Immunostainings in retinal tissue as well as in transfected hippocampal neurons revealed a co-localization of SUMOylating enzymes with mGluR8b. A very interesting GABACR binding partner was identified with PNUTS, that contains a binding motif for the catalytic subunit of the protein phosphatase 1 (PP1γ1): PNUTS therefore is able to bind GABACR and PP1γ1 simultaneously and, indeed, this trimeric protein-complex could be detected. GABACR are expressed in rod bipolar cells within the retina and all interaction partners were observed in these cell types by using immunohistochemical methods. Upon co-expression with GABACR, PNUTS showed a dynamic subcellular distribution from the nucleus towards the outer membrane in cell-culture experiments. Neurotransmitter receptor concentration in the outer membrane is regulated by phosphorylation. Therefore, the hypothesis was tested, if the association of PP1γ1 to GABACR via PNUTS could inhibit the internalization rate of the receptor. Indeed, a significantly reduced internalization of GABACR was observed when co-expressed with PNUTS and PP1γ1 in transfected HEK-293 cells. In summary, this work describes new molecular mechansims in the synaptic processing of visual information in the retina and the central nervous system.
Abstract
Die neuronale Signalverarbeitung setzt sich aus einer fein abgestimmten und komplex regulierten Verknüpfung exzitatorischer und inhibitorischer Signalwege zusammen. Der metabotrope Glutamatrezeptor 8 (mGluR8) und der ionotrope GABAC-Rezeptor (GABACR) modulieren die Verarbeitung der Lichtinformation in der Retina, wobei beide Rezeptoren durch intrazelluläre Bindepartner reguliert werden. Putative Interaktionspartner waren bereits in vorhergehenden Arbeiten in Hefezellen identifiziert worden. In dieser Arbeit konnte die Protein-Protein Interaktion des Bande 4.1B Proteins mit mGluR8a/b verifiziert werden. Eine Co-Lokalisierung wurde in retinalem Gewebe ebenso wie in transfizierten HEK-293 Zellen und hippocampalen Neuronen detektiert. Funktionelle Auswirkungen der Interaktion wurden zunächst in einem Biotinylierungs-Assay untersucht, der einen Anstieg der Zelloberflächenkonzentration der Glutamatrezeptoren nach Co-Expression mit dem Bande 4.1B Protein zeigte. Die Co-Expression mit dem Bande 4.1B Protein führte zudem zu einer Inhibition der Rezeptor-vermittelten Reduktion der intrazellulären cAMP-Konzentration. Als weitere putative mGluR8b Interaktionspartner waren im Labor bereits PIAS1/3 und Ubc9, wichtige Enzyme der SUMOylierungskaskade, identifiziert worden. In dieser Arbeit wurden diese Protein-Protein Interaktionen verifiziert. Durch Einführung von Mutationen in mGluR8b konnten die zur SUMOylierung notwendigen intrazellulär lokalisierten Lysinreste kartiert werden. Die Expression der Enzyme der SUMOylierungskaskade in der Retina wurde mittels RT-PCR nachgewiesen und deren Co- Lokalisierung mit GluR8b sowohl in der Retina, als auch in transfizierten hippocampalen Neuronen durch Immunfärbungen gezeigt. Für den GABAC-Rezeptor war mit PNUTS bereits ein äußerst interessanter Interaktionspartner identifiziert worden, der zudem über ein Bindemotiv für die katalytische Untereinheit der Protein Phosphatase 1 (PP1γ1) verfügt. Daher könnte PNUTS gleichzeitig an GABACR sowie PP1γ1 binden und tatsächlich konnte dieser trimere Proteinkomplex nachgewiesen werden. In der Retina sind GABACR in Stäbchen-Bipolarzellen exprimiert, und alle Interaktionspartner wurden mittels immunhistochemischer Methoden in diesem Zelltyp nachgewiesen. Zellkulturexperimente zeigten für PNUTS eine dynamische subzelluläre Verteilung vom Zellkern zur Plasmamembran in Abhängigkeit der Co-Expression von GABACR. Die Konzentration von Neurotransmitter-Rezeptoren in der Plasmamembran wird durch Phosphorylierung reguliert. Daher wurde die Hypothese überprüft, ob die Assoziation von PP1γ1 über PNUTS an den GABACR eine Internalisierung des Rezeptors verhindern kann. Tatsächlich zeigte sich eine signifikant reduzierte Internalisierungsrate des GABACR nach Co-Expression mit PNUTS und PP1γ1 in transfizierten HEK-293 Zellen. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit neue molekulare Mechanismen zur synaptischen Verarbeitung der Sehinformation in der Retina und im zentralen Nervensystem.