Novel strategies to improve the efficiency of therapeutic adenoviruses for the treatment of cancer
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The resistance of cancers to conventional therapies has inspired the search for novel anti-cancer strategies. Two such promising approaches are gene therapy and virotherapy. Gene therapy involves the delivery of therapeutic transgenes, frequently by means of viral vectors, to tumor tissues to selectively kill them. In contrast, virotherapy is defined as killing of cancer cells by specific virus infection, replication, cell lysis and virus spread by so-called oncolytic viruses. Successful implementation of gene therapy requires efficient and targeted gene transfer vectors. Therapeutic gene transfer by replication-deficient or more recently by replication-competent/oncolytic adenoviruses (OAds) has shown much promise. However, for specific applications an external control of transgene expression might be crucial. The 1st project, for the first time, investigated the feasibility of a 245bp fragment of the human hsp70B' promoter for heat-regulated transgene expression in combination with either replication-deficient or oncolytic adenoviruses. In transient transfection assays this promoter demonstrated low basal activities with induction ratios up to 3741-fold. In context of a replication-deficient Ad, heat-stimulus resulted in 586-fold increased luciferase activity for SK-MEL-28 cells, but was only 44-fold for HeLa cells due to higher basal activities. To improve the heat-inducibility, two novel Ad vectors with an insulated hsp70B' promoter were developed that feature stringent heat-inducible gene expression with induction ratios up to 8000-fold. However, in a melanoma-targeted OAd regulation of the hsp70B' promoter was lost specifically during late replication in permissive cells and could not be restored by insulators. In summary, this study revealed that Ad vectors with insulated hsp70B' promoter have potential for gene therapy applications that require external control of transgenes. Moreover, it shows that vector replication can deregulate inserted promoters, which needs to be considered for the development of transcriptionally regulated oncolytic gene transfer vectors. Adenoviruses have been intensively exploited for virotherapy approaches. Clinical trials have demonstrated proof of principle and a favourable safety profile, but insufficient therapeutic efficacy for these viruses. The 2nd project was designed to increase the therapeutic potency of OAds by combining two strategies: Deletion of the anti-apoptotic early viral gene E1B19K aimed at accelerated virus spread by early viral release from tumor cells, and was coupled with strategies for insertion of transgenes into the late viral transcription unit. Here the goal was the replication-dependent expression of therapeutic genes to work in concert with viral oncolysis (“armed” OAd). However, it remained to be demonstrated whether early lysis of cancer cells aborts efficient transgene expression or better spread might increase it. Deletion of E1B19K was analyzed in a panel of tumor cell cultures that resulted either in increased early viral release and enhanced cell lysis or in reduced virus replication and oncolysis dependent on the cell type. It could be shown that these opposing phenotypes do not result from differences in apoptosis induction. Deletion of E1B19K rather affected virus replication and release distinctly. Nevertheless, reporter gene assays revealed that E1B19K deletion, despite of earlier induction of apoptosis during viral replication, in cells susceptible for early lysis did not interfere with late transgene expression; luciferase expression by the E1B19K- virus was even superior over time compared to the E1B19K+ virus due to better virus spread. Thus, the E1B19K- virus showed >3 orders of magnitude increased oncolysis and transgene expression 10 days post-infection. Importantly, this study shows that early virus release accelerates spread and tumor cell killing and even dramatically increases expression of transgenes inserted into the viral genome in several tumor types. Considering the clearance of virus by anti-viral immunity such accelerated phenotype has the potential to improve “armed” OAds in cancer therapy.
Abstract
Nicht zuletzt die Resistenz vieler Tumoren gegenüber konventionellen Therapien, begründet die Suche nach neuen Strategien zur Krebsbekämpfung. Zwei innovative Krebstherapien sind Gentherapie und Virotherapie. Ziel der Gentherapie ist es, therapeutische Gene, vorwiegend mittels viraler Vektoren, in Tumorzellen einzufügen, um diese selektiv zu töten. In der Virotherapie dagegen, werden Tumorzellen mit tumorspezifisch replikationsfähigen Viren (=onkolytische Viren) infiziert und durch deren lytischen Replikationszyklus zerstört. Erfolgreiche Gentherapieansätze erfordern effiziente und zielgerichtete Gentransfer-Vektoren. Therapeutischer Gentransfer mittels replikationsdefizienter und neuerdings auch mit Hilfe replikationskompetenter/onkolytischer Adenoviren (OAds) erwies sich als vielversprechend. Spezielle Anwendungen können jedoch eine externe Kontrolle der Transgenexpression erfordern. Hierzu analysierte das erste Projekt erstmals ein 245bp Fragment des humanen hsp70B’ Promoters bezüglich seiner Fähigkeit Hitze-regulierbare Transgenexpression im Kontext von replikations-defizienten oder onkolytischen Ads zu vermitteln. In Transfektionsstudien zeigte dieser Promoter geringe basale Aktivität; nach Hitze-Induktion stieg die Aktivität dagegen bis zu 3741-fach an. Nach Insertion des hsp70B’ Promoters in ein nicht-replizierendes Ad, führte Hitzeschock zu einer 586-fachen höheren Luziferase Aktivität in SK-MEL-28 Zellen; diese war in HeLa Zellen, aufgrund höherer basaler Aktivität, nur 44-fach. Zur Verbesserung der Hitze-Induzierbarkeit wurden zwei neue Ad Vektoren generiert, die mit Hilfe von Isolatoren oberhalb des hsp70B’ Promoters zu einer stringenteren Hitze-induzierbaren Genexpression mit bis zu 8000-fachen Induktionsraten führte. Dagegen in einem melanom-spezifischen OAd war die Regulation des hsp70B’ Promoters, insbesondere während der späten Virus-Replikation, aufgehoben und konnte auch durch Isolatoren nicht wiederhergestellt werden. Die Studie verdeutlicht somit, dass sich Ad Vektoren mit isoliertem hsp70B’ Promoter speziell in Gentherapien einsetzen ließen, die eine externe Kontrolle von Transgenen erfordern. Zudem zeigt sie, dass die Replikation von Vektoren zur Deregulation inserierter Promotoren führen kann, was bei zukünftigen Entwicklungen transkriptionell regulierter onkolytischer Gentransfer-Vektoren berücksichtigt werden sollte. Adenoviren wurden auch vielfach in Virotherapien eingesetzt. Klinische Studien haben das Potential und die Sicherheit von OAds bewiesen, aber auch deren unzureichende therapeutische Wirksamkeit. Ziel des zweiten Projekts war es, durch Kombination zweier Strategien die therapeutische Effizienz von OAds zu steigern: Die Deletion des anti-apoptotischen, frühen viralen Gens E1B19K, die auf beschleunigte Virusstreuung durch frühere Virenfreisetzung aus Tumorzellen abzielte, wurde mit der Insertion von Transgenen in die späte virale Transkriptionseinheit kombiniert. Bis dato war nicht bekannt, ob sich vorzeitige Tumorzelllyse nachteilig auf die späte Transgenexpression auswirkt. Analysen der E1B19K-Deletion resultierten in einigen Tumorzellkulturen in verstärkter früher Virusfreisetzung und gesteigerter Zelllyse, in anderen dagegen in reduzierter Onkolyse. Diese Diskrepanz war jedoch nicht auf mutationsbedingte Unterschiede in der Apoptose-Induktion zurückzuführen. Vielmehr bedingte die E1B19K-Deletion eine beschleunigte Virusfreisetzung bzw. reduzierte Virusreplikation und Onkolyse. Erstere hatte jedoch keine nachteilige Wirkung auf die späte Transgenexpression, die dadurch eher verbessert wurde und für das E1B19K- Virus eine um 3 log-Stufen gesteigerte Onkolyse und Transgenexpression in A549 Zellen ergab. Somit zeigt die Studie, dass frühe Virusfreisetzung nicht nur die Virusstreuung und damit die Onkolyse beschleunigt, sondern dass sie gleichzeitig die Transgenexpression verstärkt. Im Hinblick auf die rasche Neutralisierung durch anti-virale Immunität, könnte ein solch beschleunigter Phänotyp die Effizienz von transgentragenden OAds wesentlich verbessern.