Characterization of Virus host-interactions that regulate HIV-1 replication
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Abstract
Retroviruses like the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) are obligate cellular parasites that depend on host cell factors for their replication. The aim of this study was to characterize two specific cases of these numerous virus-host interactions. First, the previously identified interaction between the cellular peptidyl-prolyl cis/trans isomerase cyclophilin A (CypA) and the HIV-1 accessory protein Vpr was investigated on the molecular level. HIV-1 Vpr induces G2 cell-cycle arrest and apoptosis in infected cells, and it facilitates the transport of the pre-integration complex into the nucleus of non-dividing cells. This multi-functional protein interacts with a variety of cellular factors, among them CypA. Although an N-terminal sequence in Vpr comprising proline residues in positions 5, 10, and 14 resembles the previously described CypA binding site in HIV-1 capsid, it was shown that the interaction between CypA and Vpr is regulated by a downstream proline in position 35 (Pro-35). To investigate the relevance of these proline residues for HIV-1 replication, individual mutations of all four proline residues were introduced in R5-tropic HIV-1 variants, which predominantly replicate in macrophages, and in X4-tropic viruses that primarily infect T cells. Comprehensive replication studies in human lymphoid tissue cultivated ex vivo revealed that only Pro-35 is required for efficient replication of R5-tropic variants, but not for X4-tropic viruses. In an attempt to clarify the cause of this phenomenon, it was observed that none of the proline mutations has an effect on the Vpr-mediated apoptosis and G2 cell-cycle arrest as well as on the expression and sub-cellular localization of Vpr. In contrast, however, the capacity for encapsidation into budding virions, which is mediated via binding of Vpr to the p6 domain of the Gag polyprotein, is significantly reduced by mutation of Pro-35. 1H-NMR spectroscopy revealed that mutation of Pro-35 results in a significant increase in the alpha-helical structure that will merge the two N-terminal helices of the full length molecule. Thus, Pro-35, potentially in concert with CypA or other host cell chaperones, regulates the conformation of the hydrophobic core of the molecule, whose integrity is required for encapsidation of Vpr and thus, is necessary for a productive infection of macrophages The second example of virus host interactions investigated in this thesis was the ubiquitination of ALIX (ALG-2 interacting protein X) by POSH (Plenty of SH3) and the functional relevance of this interaction for HIV-1 release. ALIX represents an ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) associated adaptor protein with multiple functions in intracellular protein trafficking and plays a central role in the release of various enveloped viruses through interaction with the consensus YPXnL late (L)-domain motif. It was previously demonstrated by our collaboration partners that the ubiquitin E3 ligase POSH augments HIV-1 release by facilitating the transport of Gag to the cell membrane. Recently, it was reported, that POSH enhances ALIX mediated phenotypes in Drosophila. It was therefore a legitimate question to investigate of whether ALIX and POSH cooperate in terms of virus budding. In collaboration with our partners, it was found that POSH binds to ALIX in human cells. It was also observed that ALIX is an ubiquitination substrate of POSH. Wild type POSH, but not an ubiquitination inactive RING finger mutant (POSHV14A), induces formation of poly-ubiquitin chains on ALIX in vivo and in vitro. Yet, this poly-ubiquitination does not induce proteasomal degradation of ALIX. Further it was demonstrated that wild type POSH, but not the POSHV14A mutant, substantially enhances ALIX mediated Gag processing and release of infectious virions of an L-domain mutant HIV-1deltaPTAP variant. Additionally, the impact of POSH on an ALIX dependent HIV-1/EIAV (equine infectious anemia virus) hybrid (HIV-p9), in which the p6 domain in Gag was replaced by the corresponding p9 domain of EIAV was investigated. Consistent with the findings observed for HIV-1, POSH also augments the release of virus particles derived from this strictly ALIX-dependent hybrid-virus. In further agreement with the idea of a cooperative function of POSH and ALIX, silencing of ALIX by RNAi (RNA interference) or mutating the ALIX binding site in Gag completely abrogated augmentation of virus release by over-expression of POSH. However, the effect of the POSH mediated ubiquitination of ALIX appears to be auxiliary, but not necessary, as silencing of POSH by RNAi does not disturb ALIX mediated rescue of HIV-1 L-domain mutants. Thus, the cumulative results identified ALIX as an ubiquitination substrate of POSH and indicate that POSH and ALIX cooperate to facilitate efficient virus release in a process that may involve POSH-mediated ubiquitination of ALIX.
Abstract
Retroviren wie das humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) sind Zellparasiten und für ihre Replikation auf die Interaktion mit Proteinen der Wirtszelle angewiesen. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung zweier Beispiele dieser Virus- Wirt-Interaktionen. Zunächst wurde die bereits zuvor beschriebene Interaktion zwischen der Peptidyl-prolyl cis/trans Isomerase Cyclophilin A (CypA) und dem HIV-1 akzessorischen Protein Vpr auf molekularer Ebene untersucht. HIV-1 Vpr induziert in infizierten Zellen G2 Zellzyklus Arrest sowie Apoptose und erleichtert den Transport des viralen Prä-Integrations-Komplexes in den Zellkern von sich nicht teilenden Zellen. Obwohl die N-terminale Aminosäurensequenz von Vpr bestehend aus den Prolinen 5, 10 und 14, der bekannten CypA Bindestelle in HIV-1 Capsid ähnelt, wurde gezeigt, dass die Interaktion von CypA und Vpr von einem Prolin an Position 35 reguliert wird. Um die Bedeutung der Prolin Reste für die Replikation von HIV-1 zu untersuchen, wurden Mutationen aller Prolin Reste in R5-trophe HIV-1 Varianten, welche vornehmlich in Makrophagen replizieren, und X4-trophe Viren, welche hauptsächlich T-Zellen infizieren, eingefügt. Replikationsstudien in ex vivo kultivierten, human Lymphgewebe zeigten nun, dass ausschließlich Pro-35 wichtig ist für die Replikation von R5-trophen, nicht aber von X4-trophen HIV-1. Beim Versuch, die Ursache dafür zu klären wurde gefunden, dass keine der Prolin-Mutationen einen Einfluss auf die Vpr induzierte Apoptose und den G2 Zellzyklus Arrest hat. Ebenso werden die Expression und subzelluläre Lokalisation von Vpr nicht verändert. Im Gegensatz dazu jedoch war die Fähigkeit von Vpr in die sich bildenden Virionen eingebaut zu werden, welche durch die Bindung an die p6-Domäne des Gag Proteins vermittelt wird, bei einer Mutation von Pro-35 deutlich reduziert. NMR Spektroskopie zeigte, dass die Mutation von Pro-35 eine verstärkte alpha-helikale Struktur zur Folge hat, wodurch die beiden N-terminalen Helices des Moleküls fusionieren. Demnach reguliert Pro-35, möglicherweise im Zusammenspiel mit CypA, die Konformation des hydrophoben Kern-Bereichs des Moleküls, dessen Integrität wichtig ist für den Einbau von Vpr in Virionen, und daher notwendig ist für di Replikation in Makrophagen. Die zweite Virus-Wirt Interaktion, welche in dieser Arbeit untersucht wurde, war der Einfluss der Ubiquitinylierung von ALIX (ALG-2 interacting protein X) durch POSH (Plenty of SH3) auf die Freisetzung von HIV-1. ALIX ist ein mit dem ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) assoziiertes Protein mit verschiedensten Funktionen im intrazellulären Proteintransport und spielt eine zentrale Rolle bei der Freisetzung Viren durch die Interaktion mit dem Konsensus YPXnL late (L)-Domänen Motiv. Schon vorher wurde von unseren Kooperationspartnern gezeigt, dass die E3 Ubiquitin-Ligase POSH die Freisetzung von HIV-1 erhöht. Vor kurzem wurde auch beschrieben, dass POSH ALIX abhängige Phänotypen in Drosophila verstärkt. Basierend auf dieser Entdeckung wurden Untersuchungen zur Klärung der Frage veranlasst, ob ALIX und POSH zum Zweck der Virus-Freisetzung interagieren. In Kooperation mit unseren Partnern wurde gefunden, dass ALIX ein Ubiquitinylierungs-Substrat von POSH ist. Wildtyp POSH, aber nicht eine Ubiquitinylierungs-defiziente RING-Finger Mutante (POSHV14A) induzierte die Bildung von Poly-Ubiquitin Ketten an ALIX in vivo und in vitro. Diese Ubiquitinylierung induzierte jedoch keinen proteasomalen Abbau von ALIX. Ferner konnte gezeigt werden, dass Wildtyp POSH, aber nicht die POSHV14A Mutante, die ALIX vermittelte Gag-Prozessierung und Virus-Freisetzung einer HIV-1deltaPTAP Mutante entscheidend verstärkt. Außerdem wurde der Einfluss von POSH auf ein ALIX abhängiges HIV-1/EIAV (equine infectious anemia virus) Hybrid-Virus (HIV-p9) untersucht, in welchem die p6 Domäne in Gag durch die entsprechende p9 Domäne von EIAV ersetzt wurde. Übereinstimmend mit den Ergebnissen für HIV-1 verstärkte POSH auch die Freisetzung dieses strikt von ALIX abhängigem Hybrid-Virus. In weiterer Übereinstimmung mit einer kooperativen Funktion von POSH und ALIX wurde die, durch POSH Überexpression induzierte, verstärkte Virus Freisetzung zum einen durch Herunterregulation der ALIX Expression mittels RNAi (RNA Interferenz), zum anderen durch Mutationen der ALIX-Bindestelle in Gag, komplett aufgehoben. Jedoch scheint der Effekt der Ubiquitinylierung von ALIX durch POSH unterstützend, aber nicht notwendig für die Funktion von ALIX, zu sein, da die Herunterregulation der POSH Expression mittels RNAi die ALIX vermittelten Freisetzung von HIV-1 L-Domänen Mutanten nicht verringert. Zusammenfassend wurde ALIX als Ubiquitinylierungs Substrat von POSH identifiziert und es wurden Hinweise darauf erbracht, dass POSH und ALIX in einem Prozess zusammenwirken, der eventuell die POSH- vermittelte Ubiquitinylierung von ALIX beinhaltet, um die effiziente Virusfreisetzung zu ermöglichen.