Einfluss der Prozessivität der Reversen Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ I auf die G-zu-A Mutationsrate induziert durch APOBEC3-Proteine
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The genomic diversity of HIV-1 and the viruss ability to adjust to new conditions by mutagenesis are main obstacles for effective vaccines and virus eradication. It is important to clarify the mechanisms as well as the viral and cellular factors influencing this heterogeneity to understand the pathogenesis of HIV-1 and to push the development of new antiretroviral strategies forward. According to the latest state of knowledge, both, the viral RT and the cellular protein family APOBEC3, especially APOBEC3G, account to the diversity of this virus. Therefore, the aim was to investigate a possible interaction of both factors. Thus, the impact of the processivity of HIV-1 RT on the APOBEC3 induced mutagenesis rate was examined. H9 cells (T-cell line) and PBMCs of different donors were infected with Vif-deficient HIV-1. So it was guaranteed that APOBEC3 proteins were incorporated into the newly produced viral particles. In the next round of infection, these proteins deaminate cytidine into urcacil within the viral cDNA and lead consequently to G-to-A hypermutation in the viral plus strand. The viruses differed in their RT variants, and thus, exhibited different RT processivities. It was shown, that the processivities of RTs correlate significantly and inversely to the G-to-A mutation rate in H9 cells as well as in PBMCs. Thus, the APOBEC3 induced deamination of viral DNA is a time-dependend process that can be influenced by the HIV-1 RT. Furthermore, the analyses of ~450 env clones showed that the G-to-A mutation level of viral DNA derived from infected PBMCs was significantly lower than that derived from H9 cells. This was not expected as the reverse transcription is slower in PBMCs compared to cell lines. Theoretically, this should result in a higher mutation rate. Moreover, on average 38% of the viral DNAs derived from PBMCs did not contain any G-to-A mutations. Nevertheless, these viruses were replication incompetent, indicating that APOBEC3 proteins possess further deamination independend antiretroviral activities; or that Vif inhibits so far unknown antiretroviral factors.
Abstract
Die genomische Diversität von HIV-1 und die Fähigkeit des Virus, sich schnell durch Mutagenese seines Genoms an verändernde Bedingungen anzupassen, sind Hauptursachen dafür, dass es bis heute weder einen wirksamen Impfstoff noch eine Virus-eradizierende Therapie gibt. Die Aufklärung der Mechanismen und der viralen und zellulären Faktoren, die diese Heterogenität beeinflussen, ist wichtig für das Verständnis der Pathogenese von HIV-1 und der Entwicklung neuer antiretroviraler Strategien. Die virale RT und die zelluläre Proteinfamilie APOBEC3, insbesondere APOBEC3G, tragen beide nach neuen Erkenntnissen maßgeblich zu dieser Wandlungsfähigkeit des Virus bei. Das Ziel war es daher, eine mögliche Interaktion dieser beiden wichtigen Faktoren zu ermitteln. Dazu wurde der Einfluss der Prozessivität der viralen RT auf die durch APOBEC3 induzierte Mutationsrate untersucht. Hierfür wurden H9 Zellen (T-Zelllinie) und periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMCs) verschiedener Spender mit HI-Viren infiziert, die das virale Protein Vif nicht exprimieren können. Dadurch ist gewährleistet, das APOBEC3 Proteine in das Viruspartikel eingebaut werden. In der nächsten Infektionsrunde deaminiert dieses Protein Cytidine in der viralen cDNA und führt dadurch zur G-zu-A Hypermutation im viralen Plusstrang. Die verwendeten HI-Viren unterschieden sich in ihren RTs, die unterschiedliche Prozessivitäten aufwiesen. Es konnte gezeigt werden, dass die Prozessivität der RT signifikant invers korreliert zur G-zu-A Mutationsrate in der T-Zelllinie H9 sowie in primären Zellen. Dies bedeutet, dass es sich bei der APOBEC3-induzierten Deamination viraler DNA um einen Zeit-abhängigen Prozess handelt, der durch die virale RT beeinflusst werden kann. Desweiteren haben die Analysen von insgesamt etwa 450 env-Klonen ergeben, dass die G-zu-A Mutationsrate viraler DNA aus infizierten PBMCs signifikant niedriger ist als die aus H9 Zellen. Dies war ein unerwartetes Ergebnis, da die reverse Transkription in PBMCs langsamer verläuft als in T-Zelllinien, was theoretisch zu einer höheren Mutationsrate führen sollte. Außerdem wies die virale DNA in durchschnittlich 38% aller aus PBMCs stammenden Klone keine G-zu-A Mutationen auf. Trotzdem waren diese Viren Replikations-inkompetent, was bedeutet, dass APOBEC3 Proteine noch weitere Deaminations-unabhängige antiretrovirale Aktivitäten besitzen oder dass Vif noch weitere bislang unbekannte antiretrovirale Faktoren inhibiert.