Daniela Martínez Jaramillo

• Der brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung können diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit MutationenDer brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung können diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit Mutationen induzieren können. Eine niedrige COMT-Aktivität, durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, könnte daher die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Hemmung der COMT-Aktivität auf die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen untersucht. Zu diesem Zweck wurden der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Test und der Mikrokern-Test eingesetzt. Die Untersuchungen erfolgten in kultivierten Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) und in V79-Zellen, die mit hCYP1A1 transfiziert wurden. Begleitend zu den Mutagenitätsuntersuchungen wurde das Metabolitenprofil der Testsubstanzen anhand von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie bestimmt. Nach Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 wurde dieses vollständig zu dessen Methylcatecholen umgesetzt, ab 2,5 µM hingegen war zusätzlich 2 HO-E2 im Medium nachweisbar. Demnach war die Hemmung der COMT-Aktivität bei der Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 vollständig und ab 2,5 µM partiell. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität war 2 Methoxyestradiol der Hauptmetabolit. 2-HO-E2 induzierte im Konzentrationsbereich 0,08 µM - 5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mutantenfrequenz im hprt-Lokus von V79-Zellen. Im Gegensatz hierzu induzierte 2 HO-E2 ab 2,5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, mindestens eine Verdreifachung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation, wobei dieser Effekt ohne Inhibierung der COMT-Aktivität stärker ausgeprägt war. Über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich (5 - 40 µM) wurde 4 HO-E2 zu dessen beiden Methylcatecholen umgesetzt, wobei 4-Methoxyestradiol den größten Anteil der detektierten Verbindungen (≥ 86%) ausmachte. Nach der Behandlung mit 3,5-Dinitrocatechol waren keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar, weswegen von einer vollständigen Hemmung der COMT-Aktivität im gesamten getesteten Konzentrationsbereich auszugehen war. 4-HO-E2 induzierte über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich keine Genmutationen im hprt-Lokus. Erst nach Hemmung der COMT-Aktivität und Behandlung mit 20 µM 4 HO-E2 wurde eine Verdreifachung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität induzierte 4 HO E2 ab 20 µM eine Verdopplung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation. Im Kulturmedium der V79 hCYP1A1-Zellen, die mit 0,1 und 1 µM E2 für bis zu drei Wochen behandelt wurden, machten über die gesamte Versuchsdauer E2 (> 86%) und Estron (> 10%, bezogen auf die Summe aller Peakflächen) den größten Anteil der detektierten Verbindungen aus. Wie erwartet, waren nach Hemmung der COMT-Aktivität keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar. Die durchgehende, zwei- und dreiwöchige Behandlung mit jeweils 0,1 und 1 µM E2 bewirkte keine Induktion von Genmutationen im hprt-Lokus. Demgegenüber erhöhte sich die Mutantenfrequenz nach Hemmung der COMT-Aktivität und dreiwöchiger Behandlung mit 0,1 µM E2 um Faktor 4 im Vergleich zur Kontrollpopulation. Was die Mikrokerninduktion betrifft, so wurde nach 24-stündiger Inkubation mit 0,1 und 1 µM E2, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Über die gesamte Dauer der Mutagenitätstests von E2 und dessen Catecholestrogenen unterschieden sich die Zellzyklusverteilung, die Wachstumskurven und die Koloniebildungsfähigkeit zum Zeitpunkt der Selektion, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, nicht statistisch signifikant von denjenigen der Kontrollpopulationen. Demnach war von einer sicheren Detektion von Mutationen im HPRT-Test und im Mikrokerntest auszugehen. Zusammenfassend bestätigen die durchgeführten Untersuchungen, dass die zelluläre COMT-Aktivität eine essentielle Rolle zur Entgiftung mutagener Catecholestrogene spielt. Eine hundertprozentige Inhibierung der Aktivität dieses Enzyms führt zur Induktion von Genmutationen durch 4 HO-E2 in V79-Zellen ohne CYP-Aktivität und durch E2 in V79-Zellen, die hCYP1A1 exprimieren. Demnach könnte eine Reduktion der COMT-Aktivität durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, die Induktion von Genmutationen durch E2 und dessen Catecholestrogenen begünstigen.…
• Oxidative metabolism of the female sex hormone 17β-estradiol (E2) is considered to play a major role in the initiation of hormone-induced carcinogenesis. In extrahepatic tissues, E2 undergoes metabolic activation by human cytochrome P450-dependent monooxygenase (CYP) isozymes 1A1 (hCYP1A1) and 1B1 (hCYP1B1) to 2-hydroxy (HO)- and 4-HO-E2. If not conjugated these catecholestrogens can further oxidize to electrophilic quinones, which may react with DNA and induce thereby mutations. Conjugation of these catechols in extrahepatic tissues is mainlyOxidative metabolism of the female sex hormone 17β-estradiol (E2) is considered to play a major role in the initiation of hormone-induced carcinogenesis. In extrahepatic tissues, E2 undergoes metabolic activation by human cytochrome P450-dependent monooxygenase (CYP) isozymes 1A1 (hCYP1A1) and 1B1 (hCYP1B1) to 2-hydroxy (HO)- and 4-HO-E2. If not conjugated these catecholestrogens can further oxidize to electrophilic quinones, which may react with DNA and induce thereby mutations. Conjugation of these catechols in extrahepatic tissues is mainly catalyzed by catechol-O-methyltransferase (COMT). A low COMT activity, caused for example by polymorphisms and certain food components, which influence the enzyme activity or its gene expression, may therefore enhance quinone formation and thereby the induction of mutations. The aim of the present work was to determine the effect of inhibition of COMT on the mutagenic potential of a) the catechols 2- and 4-HO-E2 in V79 wild type cells without CYP activity and b) E2 in V79 cells expressing hCYP1A1. 3,5-dinitrocatechol (20 μM) served as COMT inhibitor. Gene and chromosomal mutations were assessed using the hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HPRT) and the micronuclei assay. In addition, the metabolite profile of E2 and its catechols in the culture medium was analyzed via gas chromatography/mass spectrometry. After incubation of V79 cells with 2-HO-E2, 2-methoxyestradiol was the major metabolite, whereas in the presence of the COMT inhibitor, disappearance (0.08 μM) and a decreased amount (2.5 μM or more) of methylated inactivation products was observed. Treatment of V79 cells with 0.08 μM – 5 μM 2-HO-E2, neither with nor without inhibition of COMT activity induced a significant increase in mutant frequency at the hprt locus. In contrast, at concentrations above or equal to 2.5 μM 2-HO-E2, at least a 3-fold increase of the micronuclei rate compared to control cells was observed with and without inhibition of COMT activity. Over the entire concentration range (5-40 μM) 4-HO-E2 was mainly converted to its methylation products, 4-methoxyestradiol being the major metabolite (≥ 86%) of the detected compounds. After treatment with 3,5-dinitrocatechol no methylation products were detected, thus indicating a complete inhibition of COMT over the entire concentration range. 4-HO-E2 did not induce gene mutations at the hprt locus in V79 cells with active COMT. Yet, after inhibition of COMT and treatment with 20 μM 4-HO-E2, a 3-fold increase in the mutant frequency was observed in comparison to control cells. Like 2-HO-E2, induction of micronuclei by 20 µM 4-hydroxyestradiol and more, was not affected by inhibition of COMT. In the culture medium of V79 cells expressing hCYP1A1, which were incubated with 0.1 and 1 μM E2 for up to three weeks, over the entire assay duration, E2 and estrone (86% and 10% of the sum of all peak areas, respectively) were the major metabolites. As expected, no methylation products were detected after inhibition of COMT. Treatment of V79 cells expressing hCYP1A1, for two and three weeks with 0.1 and 1 μM E2 did not induce gene mutations at the hprt locus. In contrast, a 4-fold increase in mutant frequency was observed in comparison to control cells after inhibition of COMT and treatment with 0.1 μM E2 for three weeks. With and without inhibition of COMT, no increase in micronuclei rate compared to control cells was observed after incubation with 0.1 and 1 μM E2 for 24 hours. Over the entire duration of the mutagenicity assays of E2 and its catechols, cell cycle distribution, cell growth and plating efficiency at the time of mutant selection, with and without inhibition of COMT, did not differ statistically significant from control cells; therefore a reliable detection of mutations in the micronuclei and the HPRT assay can be assumed. The present work confirms that cellular COMT is essential for the inactivation of mutagenic catechols. Complete inhibition of its enzyme activity results in the induction of gene mutations by 4-HO-E2 in V79 wildtype cells without CYP activity and also by E2 in cells expressing hCYP1A1. Polymorphisms and food components lowering COMT activity could therefore mediate the potential of E2 and its metabolites to induce gene mutations.…