Ramkumar Ramani Mohan

• Critical size bone defects and nonunion fractures remain difficult to treat. Although cell‐loaded bone substitutes have improved bone ingrowth and formation, the lack of methods for achieving viability and the uniform distribution of cells in the scaffold limits their use as bone grafts. In addition, the predominant mechanical stimulus that drives early osteogenic cell maturation has not been clearly identified. Further, it is challenging to evaluate mechanical stimuli (i.e., deformation and fluid–flow-induced shear stress) because they areCritical size bone defects and nonunion fractures remain difficult to treat. Although cell‐loaded bone substitutes have improved bone ingrowth and formation, the lack of methods for achieving viability and the uniform distribution of cells in the scaffold limits their use as bone grafts. In addition, the predominant mechanical stimulus that drives early osteogenic cell maturation has not been clearly identified. Further, it is challenging to evaluate mechanical stimuli (i.e., deformation and fluid–flow-induced shear stress) because they are interdependent. This thesis compares different mechanical stimuli applied to cell-seeded scaffolds to develop bone grafts efficiently for the treatment of critical size bone defects. It also seeks to understand how deformation strain and interstitial fluid–flow-induced shear stress promote osteogenic lineage commitment. In this thesis, different scaffolds were seeded with primary human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) from different donors and subjected to static and dynamic culture conditions. In contrast with the static culture conditions, homogenous cell distributions were accomplished under dynamic culture conditions. Additionally, the induction of osteogenic lineage commitment without the addition of soluble factors was observed in the bioreactor system after one week of cell culture. To determine the role of mechanical stimuli, a bioreactor was developed to apply mechanical deformation force to a mesenchymal stem sell (MSC) line (telomerase reverse transcriptase (TERT)) expressing a strain-responsive AP-1 luciferase reporter construct on porous scaffolds. Increased luciferase expression was observed in the deformation strain compared with the shear stress strain. Furthermore, the expression of osteogenic lineage commitment markers such as osteonectin, osteocalcin (OC), osteopontin, runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphate (AP), and collagen type 1 was significantly downregulated in the shear stress strain compared with the deformation strain. These findings establish that the deformation strain was the predominant stimulus causing skeletal precursors to undergo osteogenesis in earlier stages of osteogenic cell maturation. Finally, these findings were used to develop a bioreactor in vitro test system in which the effect of medication on osteoporosis could be tested. Primary human BM-MSCs from osteoporotic donors were subjected to strontium ranelate (an osteoporotic drug marketed as Protelos®). Increased expression of collagen type 1 and calcification was seen in the drugtreated osteoporotic stem cells compared with the nondrug-treated osteoporotic stem cells. Thus, this bioreactor technology can easily be adapted into an in vitro osteoporotic drug testing system.…
• Knochendefekte kritischer Größe und Frakturen mit Pseudoarthrose bleiben schwierig zu behandeln. Obwohl zellbeladene Knochenersatzprodukte das Einwachsen und die Bildung von Knochen verbessert haben, schränken fehlende Methoden zur Erreichung der Lebensfähigkeit und der gleichmäßigen Verteilung der Zellen im Gerüst die Verwendung von Knochenersatzprodukten als Knochentransplantate ein. Ebenfalls konnte der vorherrschende mechanische Reiz, der die frühe osteogene Zellreifung antreibt nicht eindeutig identifiziert werden. Ferner ist es schwierig,Knochendefekte kritischer Größe und Frakturen mit Pseudoarthrose bleiben schwierig zu behandeln. Obwohl zellbeladene Knochenersatzprodukte das Einwachsen und die Bildung von Knochen verbessert haben, schränken fehlende Methoden zur Erreichung der Lebensfähigkeit und der gleichmäßigen Verteilung der Zellen im Gerüst die Verwendung von Knochenersatzprodukten als Knochentransplantate ein. Ebenfalls konnte der vorherrschende mechanische Reiz, der die frühe osteogene Zellreifung antreibt nicht eindeutig identifiziert werden. Ferner ist es schwierig, mechanische Reize (d. H. Verformung und durch Flüssigkeitsströmung induzierte Scherbeanspruchung) zu bewerten, da diese Größen sie voneinander abhängig sind. Diese Arbeit vergleicht die Auswirkung verschiedener mechanischer Reize auf mit Zellen besiedelte Gerüste, um herauszufinden, ob Knochentransplantate effizient entwickelt werden können damit sie für die Behandlung von Knochendefekten einsetzbar sind. Des Weiteren wird versucht zu verstehen, wie Verformungsdehnung und durch interstitielle Flüssigkeitsströmung induzierte Scherbeanspruchung die Bindung osteogener Linien fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene Gerüste mit primären mesenchymalen Knochenmarkstammzellen (BM-MSCs) von verschiedenen Spendern ausgesät und statischen und dynamischen Kulturbedingungen ausgesetzt. Im Gegensatz zu den statischen Kulturbedingungen wurde unter dynamischen Kulturbedingungen eine homogene Zellverteilungen erreicht. Zusätzlich wurde im Bioreaktorsystem nach einer Woche Zellkultur eine Formung einer osteogenen Linienbindung auch ohne Zusätze von löslichen Faktoren beobachtet. Um die Rolle mechanischer Stimuli zu bestimmen, wurde ein Bioreaktor entwickelt, um auf porösen Scaffolds eine mechanische Verformungskraft auf eine mesenchymale Stammzelllinie (MSC) (Telomerase Reverse Transkriptase (TERT)) auszuüben. Diese exprimiert ein auf Dehnung ansprechendes AP-1-Luciferase-Reporterkonstrukt. Eine erhöhte LuciferaseExpression wurde in der Verformungsdehnung im Vergleich zur Scherspannungsdehnung beobachtet. Darüber hinaus war die Expression von osteogenen Linien Marker wie Osteonektin, Osteocalcin (OC), Osteopontin, Runt-verwandtem Transkriptionsfaktor 2 (RUNX2), alkalischem Phosphat (AP) und Kollagen Typ 1 in der Scherbeanspruchungsbelastung im Vergleich zur Verformungsdehnung signifikant herabreguliert. Diese Befunde belegen, dass die Verformungsdehnung der vorherrschende Stimulus war, der dazu führte, dass Skelettvorläufer in früheren Stadien der osteogenen Zellreifung eine Osteogenese durchliefen. Schließlich wurden diese Ergebnisse verwendet, um ein Bioreaktor-In-vitro-Testsystem zu entwickeln, in dem die Wirkung von Medikamenten auf Osteoporose getestet werden konnte. Primäre humane BM-MSCs von osteoporotischen Spendern wurden Strontiumranelat (einem als Protelos® vertriebenen Arzneimittel zur Therapie der Osteoporose) ausgesetzt. Eine erhöhte Expression von Kollagen Typ 1 und Verkalkung wurde in den mit Arzneimitteln behandelten osteoporotischen Stammzellen im Vergleich zu den nicht mit Arzneimitteln behandelten osteoporotischen Stammzellen beobachtet. Somit kann diese Bioreaktortechnologie leicht in ein in vitro Arzneimitteltestsystem angepasst werden.…