Christoph Grun

• 1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein früher Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und über freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h früher als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden können und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes frühes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, während späte Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer Kälteexposition von A. thaliana bei 4°C über 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Darüberhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege über die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abhängigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtstärke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach stärkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach stärkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensität, der Pflanzen während der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung für die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker für eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden können und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabhängige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Blättern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach höhere Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Blättern. Darüberhinaus wurde eine 111-fach höhere Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Blättern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker für eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abhängigen Hauptweg auch ein Licht-unabhängiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ wäre es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Blättern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine veränderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine.…
• 1. To obtain reference-substances for the identification of OH-FA in plant material by GC-MS, OH-FA were made in vitro. 9- and 13-hydroxy-octadecadienoic acids were formed from linoleic acid, 9- and 13-hydroxy-octadecatrienoic acids from -linolenic acid by LOX-catalized reaction. 2. In order to compare the concentrations of oxylipins in A. thaliana during compatible and incompatible interaction, a virulent Pst-strain DC3000 and an avirulent strain avrRPM1 were utilized. The concentrations of oxylipins and salicylic acid were1. To obtain reference-substances for the identification of OH-FA in plant material by GC-MS, OH-FA were made in vitro. 9- and 13-hydroxy-octadecadienoic acids were formed from linoleic acid, 9- and 13-hydroxy-octadecatrienoic acids from -linolenic acid by LOX-catalized reaction. 2. In order to compare the concentrations of oxylipins in A. thaliana during compatible and incompatible interaction, a virulent Pst-strain DC3000 and an avirulent strain avrRPM1 were utilized. The concentrations of oxylipins and salicylic acid were investigated within 60 h after inoculation. F1-phytoprostanes, 12- and 16-OH-FA were used as markers for non-enzymatically formed oxylipins. Concentrations of 9- and 13-OH-FA, either enzymatically or non-enzymatically formed, were measured as well as phytohormones, jasmonic acid and its precursor 12-oxo-phytodienoic acid. Within the compatible interaction an increase of the amount of all measured compounds was observed. In contrast, during incompatible interaction the increases of all measured substances was seperated into two phases. In both interactions, free and esterified OH-FA- and PPF1-concentrations exhibited maxima after 48 to 60 h, an early increase after 5 to 10 h was exclusively found in the incompatible interaction. The concurrent accumulation of 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FA und PPF1 indicates that enzymatically, Photo-oxidative, and free-radical catalyzed synthesis of oxylipins takes place simultaneously. In both interactions the accumulation of esterified OH-FA and PPF1 occurred 5 - 12 h earlier than the increase of the concentrations of free OH-FA and PPF1. These results confirm the hypothesis that oxylipins are formed non-enzymatically from lipids inside cell membranes and are subsequently released by lipases. An early increase of JA- and OPDA-concentrations after 5 h was found in the incompatible interaction, while late maxima occurred in both interactions after 24 to 36 h. Therefore, OH-FA- and PPF1-accumulation took place at the same time as the increase of jasmonates after 5 h. 3. When A. thaliana plants were chilled for 2 h at 4°C an 3,3-fold incrceased formation of both, the enzymatically formed free and esterified 13-OH-FA was detected. The amount of enzymatically formed free 9-OH-FA increased 4,6-fold. In contrast, the amount of non-enzymatically formed 12- and 16-OH-FA did not increase significantly indicating that the applied mild stress conditions triggered exclusively enzymatical OH-FA-formation. 4. In order to get information about OH-FA-formation with regard to light intensity A. thaliana was infected by Pst avrRPM1 and cultivated either in the dark or in the light. When plants were cultivated in the light after 10 h an 1,1- to 3,7- fold increased formation of free and an 2,0- to 3,4-fold increased accumulation of esterified 9-, 10-, 12-, 13-, 15- und 16-OH-FA could be detected. Therefore, the light intensity during an infection with Pst avrRPM1 is an important factor for the formation of enzymatically as well as non-enzymatically formed OH-FA in planta. The 4,9-fold increase of esterified 15-OH-FA (a marker for photooxidative formation of OH-FA) in the dark contradicted the hypothesis that its formation is impossible without the impact of light. In contrast the accumulation of 15-OH-FA in the dark points to a light-independent 1O2- and subsequent 15-OH-FA-formation by a so far unknown mechanism. 5. Determination of the concentrations of OH-FA in leaves and roots of untreated plants of A. thaliana showed 13- to 31-fold higher amounts of esterified 9-,10-, 12-, 13 und 16-OH-FA in the leaves. Moreover, the amounts of esterified 15-OH-FA exceeded in leaves by the factor 111 in comparison to roots. 15-OH-FA was used as a selective marker for Photo-oxidative formation of OH-FA by 1O2. Though, 15-OH-FA occurred to an amount of 0,57 µg/g (dry weight) in roots as well. This indicates that, apart from an primarily used light depending mechanism, a second path for the formation of 15-OH-FA respectively 1O2 exists which does not depend on light strength. An alternative explanation could be the transport of 15-OH-FA from leaves to roots. 6. Compared to the wildtype plants no significant differences in the increase of OH-FA and PPF1 could be detected in NahG-, lsd1-, atrbohD and atrbohF-mutants 48 h after infiltration of Pst avrRPM1. Under the utilized conditions the genetic defects of the analyzed mutants did not cause a modified accumulation of both, enzymatically and not enzymatically formed oxylipins.…