Sarah Katharina Thomas

• The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases. For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functionalThe cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases. For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R. This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist. For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability. The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab.…
• Die Zytokine Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 sind zentrale Mediatoren in der humoralen Immunantwort und sind wesentlich an der Entstehung chronisch inflammatorischer Erkrankungen, wie Asthma, Allergien und atopischer Dermatitis beteiligt. Daher werden IL- 4 und IL-13 als wichtige therapeutische Angriffspunkte für die Behandlung atopischer Erkrankungen betrachtet. Zur Signaltransduktion aktiviert IL-4 zwei heterodimere Rezeptorkomplexe, den Typ I Rezeptor bestehend aus den Untereinheiten IL-4R und γc und den Typ II Rezeptor, der sich ausDie Zytokine Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 sind zentrale Mediatoren in der humoralen Immunantwort und sind wesentlich an der Entstehung chronisch inflammatorischer Erkrankungen, wie Asthma, Allergien und atopischer Dermatitis beteiligt. Daher werden IL- 4 und IL-13 als wichtige therapeutische Angriffspunkte für die Behandlung atopischer Erkrankungen betrachtet. Zur Signaltransduktion aktiviert IL-4 zwei heterodimere Rezeptorkomplexe, den Typ I Rezeptor bestehend aus den Untereinheiten IL-4R und γc und den Typ II Rezeptor, der sich aus IL-4R und IL-13R1 zusammensetzt. Der Typ II Rezeptor wird auch von IL-13 zur Signalweiterleitung genutzt, wodurch sich die teilweise überschneidenden Funktionen der beiden Zytokine erklären lassen. Die überlappende Rezeptornutzung erlaubt es durch eine gezielte Blockade des IL-4R-Rezeptors sowohl IL-4, als auch IL-13 gleichzeitig zu inhibieren. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung neuartiger IL-4 basierter Antagonisten. Dazu wurden ausgewählte Positionen innerhalb der IL-4 Bindestelle für γc and IL-13R1, jedoch außerhalb des Bindeepitops für IL-4R gezielt chemisch modifiziert. Im Gegensatz zu bereits existierenden Studien, die synthetische Gruppen wie Polyethylenglykol (PEG) zur chemischen Modifizierung von IL-4 nutzten, wurden in dieser Arbeit Glykane als natürliche Alternative zu PEG an IL-4 gekoppelt. Da sich Glykosylierung auf wichtige pharmakologische Eigenschaften proteinbasierter Therapeutika, wie Immunogenität oder Serum Halbwertszeit, positiv auswirken kann, würde der Zucker in dieser Strategie nicht nur den auf sterischer Hinderung basierenden inhibitorischen Effekt vermitteln, sondern könnte gleichzeitig zu einer Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften des IL-4 Inhibitors beitragen. Zur chemischen Zucker-Kopplung wurden zusätzliche Cystein-Reste in IL-4 eingebracht, deren freie Thiol-gruppen eine hochspezifische Modifizierung der IL-4 Mutanten erlauben. Die IL-4 Cystein-Mutanten wurden rekombinant in prokaryotischen und eukaryotischen Expressionssystemen hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Strategien entwickelt, die eine ortsspezifische Kopplung Amin- und Thiol-haltiger Zucker an die eingebrachten Cystein-Reste in IL-4 ermöglichen. Eine Linker-basierte Reaktion, sowie ein Kopplungsansatz, der eine Aktivierung der Thiol-Gruppe mittels Bromselenobenzol erforderte, wiesen einige Nachteile auf, die eine erhebliche Einschränkung ihrer technischen Durchführbarkeit zur Folge hatte. Eine dritte Strategie hingegen, die eine Rückfaltung derIL-4 Cystein-Mutanten in Anwesenheit von Thiol-Glykanen involvierte, erlaubte eine effiziente Herstellung von IL-4 Glykokonjugaten in Form gemischter Disulfide im Milligrammbereich. Dieser Ansatz könnte somit zur Produktion homogen glykosylierter IL-4 Antagonisten im Großmaßstab eingesetzt werden. Die Herstellung homogener Glykokonjugate mit klar definierten Glykosylierungsmuster würde es erlauben über die gekoppelten Glykanstrukturen die pharmakologischen Eigenschaften von IL-4, wie Absorption und metabolische Stabilität, gezielt zu modulieren. Die hergestellten IL-4 Glykokonjugate erwiesen sich als hochwirksame Antagonisten, die die Aktivität von IL-4 und IL-13 in zellbasierten Experimenten inhibieren konnten. Glykosylierte IL-4 Antagonisten stellen somit eine vergleichbare Alternative zu gängigen IL-4 Inhibitoren dar, die zur Behandlung von atopischen Erkrankungen eingesetzt werden, wie beispielweise der neutralisierende anti-IL-4R Antikörper Dupilumab.…